杨树生殖生物学研究进展_张志毅

第22卷　第6期
2000年11月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEI J IN G FORESTR Y UN IV ERSIT Y
Vol.22,No.6Nov.,2000
2000207218收稿
http :///periodical/bjlydxxb/
3
“九五”国家攻关课题(962011202204202)和“高等学校青年骨干教师基金”项目资助
杨树生殖生物学研究进展3
张志毅　于雪松
(北京林业大学毛白杨研究所,100083,北京;第一作者男,41岁,博士,教授)
摘要　该文介绍了杨树(Populus spp.)生殖生物学的研究概况,包括:①杨树有性生殖过程中雌雄生殖系统形态结构和细胞化学变化及其生物学意义.②雄性不育的机理.③杨树杂交不亲和性的表现和原因及其克服的方法,花粉
-柱头识别反应.④杨树生殖工程取得的成就.
关键词　杨树,生殖生物学,有性生殖,雄性不育,杂交不亲和性,生殖工程中图分类号　S792.11
Zhang Zhiyi ;Yu Xuesong.Advances in reproduction biolo gy of poplars.Journal of Beiji ng Forest ry
U niversity (2000)22(6)69～74[Ch ,56ref.]Institute of Popul us tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China.
In this article ,the advances in reproduction biology of poplars are reviewed in four respects as fol 2lows :①The morphological and cytochemical changes and the biological significance of female and male reproductive systems in sexual reproduction of poplars ;②The mechanism of male sterility in poplars ;
③The reasons and descriptions of cross incompatiblity in poplars ,the methods to overcome the cross incompatibility and the stigma pollen recognition reaction ;and ④The progress made in reproductive engineering in poplars.
Key words Popul us ,reproduction biology ,sexual reproduction ,male sterility ,cross incompati 2bility ,reproductive engineering
植物生殖生物学是在植物胚胎学的基础上发展起来的.19世纪末,随着人们对植物性别认识的不断深入,逐渐形成了以描述植物生殖过程为主的植物胚胎学.应运而生的植物生殖生物学,不仅仅用植物学的知识和技术手段对植物生殖行为进行研究,并且已经渗透到解剖学、细胞学、生理学、生物化学、遗传学和分子生物学等多学科领域,产生了实验胚胎学、植物生殖生理学和植物生殖遗传学等分支学科.植物生殖生物学与植物育种学有着密切的关系.
杨树具有速生等特点,广泛分布于欧、亚和北美洲,一般在北纬30°～72°之间[21].杨树为雌雄异株,偶有雌雄同株[28,31].目前林业生产上广泛应用的大多是人工培育的杂种无性系[21].杨树主要以无性繁殖为主,对杨树有性生殖研究较少.杨树生殖生物学的研究与农作物等草本植物相比,还处于较落后的水平.从70年代以来,随着生殖生物学理论和实验手段的不断丰富,杨树生殖生物学的研究进展很快,对杨树各派代表树种的整个有性生殖过程有
了细致的了解[1～6,11,13,36,43];对杨树受精前后的组织化学变化及其生理意义进行了探究[16～17];从细胞化学和超微结构等方面对杂交不亲和性进行了研究[12,19,20,38,45,53];利用子房、胚和花粉离体培养成功地诱导出多种杨树植株[8～10,22].
1　有性生殖过程
1.1　花药的结构、小孢子发生与花粉的发育
杨树的花药壁分为四层,由表及里依次为:表皮层、纤维层、中层和绒毡层[1,5,13].其中绒毡层对小孢子和花粉的发育有重要意义,主要是因为它分泌胼胝质酶能分解四分体胼胝质壁使小孢子分离,合成识别蛋白释放到花粉外壁,绒毡层的降解产物可作为花粉合成DNA 、RNA 、蛋白质和淀粉的原料.随着小孢子的发生和花粉的发育,腺质绒毡层细胞相应发生一系列变化[5,13].李文钿等(1988)在胡杨(P.euphratica Oliv.)花粉扫描电镜图象中发现,绒毡层与花粉壁之间有细丝相连,推测是孢粉素
“桥”,并发现绒毡层的内切向壁的乌氏体,不随绒毡层细胞的退化而消失,而是有些散落在药室中,有些转移到花粉外壁上[11].
花粉母细胞的减数分裂为同时型[1,5,6,11,24],四分体小孢子大多呈四面体形,少左右对称形[1,5,11,16].董源(1988)在毛白杨(P.tomentosa Carr.)小孢子中发现细胞自体消化细胞质的活动极为活跃,并有多层的同心圆膜状复合系统[3].刚形成的小孢子体积很快增大,渐渐变为圆形,细胞质增多,并开始液泡化,核增大,从中央移到边上[5].刘玉喜等(1979)在中东杨(P.beroli nensis Dippel.)中发现有多核和多核仁小孢子存在[24].经过短暂的休眠期,休眠期的长短与温度条件有关,毛白杨为2～7d[1].休眠期结束后,小孢子进行有丝分裂,由于纺锤体的不对称,造成分裂不均等,营养细胞明显大于生殖细胞,营养细胞内质体积累大量淀粉粒[6].樊汝汶(1983)和Rougier(1991)分别报道了美洲黑杨(P.deltoi des Marshall)雄性生殖单位(Male G erm Unit,M GU)在发育过程中细胞超微结构的变化[6,46].杨树成熟花粉属于22细胞型[1,5,11,13],球型,无萌发孔,外壁雕纹有皱波状、细网状、小穴状、颗粒状等多种形状[13,27].
1.2　大孢子发生和胚囊的发育
杨树一般为胚珠倒生,在发育的早期是双珠被,在大孢子母细胞减数分裂期内珠被滞育,并开始解体,最终成为单珠被[4,11,13,36],但大叶杨(sio2 carpa Oliv.)的内珠被不解体,一直为双珠被[18].造孢细胞直接分化为大孢子母细胞[5,36],细胞核大而明显,经减数分裂形成四分体,呈T形或直线形排列,靠珠孔端的三个大孢子退化,合点端的大孢子延伸最终发育成为八核胚囊[2,5,11,13,36],在欧美杨(P.euramericana)和胡杨中发现有时合点端第二个大孢子成为功能孢子[4,11].卵器穿透珠心伸入珠孔,卵细胞和助细胞极性相反[5,13].杨树胚囊的发育属于蓼型[2,5,11,13].
1.3　受精过程
杨树的花粉落到雌株的柱头上,一般几小时后开始在柱头上萌发,沿狭窄的花柱道进入子房[5,17,36,48,52],在此期间花粉管中的生殖细胞分裂成2个精子[13],花粉管经珠孔进入退化的助细胞,在此处或在卵细胞与次生核之间释放其内含物,进行双受精[2,13,17,36,48].反足细胞是“短命”的,受精后很快就退化[5,36].整个受精作用要消耗大量淀粉粒[17].
关于杨树受精过程中精卵结合的详细情况报道不多,对于雌雄性细胞的融合机制,雄性细胞质在受精过程中的作用,卵细胞受精前后生理生化变化等,有待于进一步深入探讨.董源(1984)认为毛白杨的受精作用是介于有丝分裂前型和有丝分裂后型之间的中间型,精子起初整个贴附在卵核的核膜上,处于静止期,随后精子进入卵核中,先是核仁合并,接着核质融合[2].朱彤等(1989)发现大叶杨的受精作用为有丝分裂前型.Russel(1990)对美洲黑杨受精前的精子进行了研究,发现精子在退化的助细胞发生液泡化,细胞质稀释,细胞核染色体浓缩,细胞质减少,核质分离[48].
1.4　胚乳和胚的发育
精核与次生核融合后,形成大的富含DNA、RNA和蛋白质的初生胚乳核,一般不经过休眠,直接开始初生胚乳核的分裂,比受精卵的分裂早[2,5,13,17,36,56],但在毛白杨中发现,有时受精卵已经形成八细胞原胚,初生胚乳核尚处于休眠状态[2].胚乳在胚的发育过程中被吸收,故成熟种子不含胚乳[5,13,17,36].杨树胚乳发育类型属于核型[2,5,13,17].
精卵融合后,进入合子休眠期,核内DNA、RNA 含量上升[17].大叶杨和小叶杨(P.si monii Carr.)的合子休眠期分别为6～8d[17]和6～10d[13].合子在休眠期并不是静止的,而是进行着十分活跃的生理过程,在大叶杨中发现,合子经历了液泡消失、合子皱缩、液泡再现、合子伸长等极性化过程[17].在杨树属各派树种中大叶杨的胚胎学特征十分特殊(见表1),大叶杨胚胎发育类型为茄型,而其他各派均为柳叶菜型[5,13].
1.5　有性生殖过程的组织化学
植物有性生殖过程中,除了形态和结构发生变化外,各种物质(DNA,RNA,蛋白质,淀粉粒和胼胝质)的含量和分布也发生相应的改变.
中国林科院朱彤等(1988)首次报道了杨树小孢子发生过程中的组织化学变化,发现大叶杨小孢子母细胞的营养源位于表皮和纤维层,绒毡层细胞和小孢子母细胞逐渐积累多糖,绒毡层细胞始终含丰富的DNA、RNA和蛋白质,RNA和蛋白质在小孢子发生过程中表现一致性的分布和含量变化[16].在小孢子发生过程中,蛋白质的作用主要是作为功能蛋白和结构蛋白参与代谢,淀粉粒则作为发育中所需的营养来源[11,16].PAS反应表明,胡杨单核花粉晚期细胞质中开始积累淀粉粒,在22细胞花粉的生长过程中,营养细胞内的淀粉粒日渐增多并增大,花粉散出前夕,淀粉粒和其他内含物的积累达到高峰[11].小孢子母细胞在减数分裂前期I开始沉积胼胝质,并逐渐加厚,到四分体后期胼胝质壁解体,释
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放出小孢子[11].
表1　杨树各派代表树种胚胎学观察结果
TABL E1The embryological observation of representative species in various poplar sections 派名种名心皮种子珠被胚胎发生类型胚乳胚囊受精所需时间参考文献大叶杨派大叶杨2～3双茄型核型蓼型6～10d17,18青杨派小叶杨2～34～6单柳叶菜型核型蓼型3～6d13,21黑杨派美洲黑杨3～44～32单柳叶菜型核型蓼型2～3d43,48欧洲黑杨2单柳叶菜型核型蓼型31白杨派毛白杨21～2单柳叶菜型核型蓼型40～48h2响叶杨2单柳叶菜型核型蓼型5～7d5
美洲山杨2单柳叶菜型核型蓼型43
银白杨2～43～4单柳叶菜型核型蓼型31胡杨派胡杨3单柳叶菜型核型蓼型11
大叶杨的大孢子母细胞、四分体及功能大孢子中含不溶性多糖较少,含RNA和蛋白质丰富,成熟胚囊中除反足细胞外充满淀粉粒,围绕在卵核及次生核周围[18],助细胞具多糖性质的丝状器,胚囊的营养来源于子房和胎座细胞内贮存的淀粉粒,卵细胞PAS反应呈阴性.受精后,胚胎发育过程中, DNA、RNA和蛋白质含量和分布发生一系列变化,游离胚乳核中RNA和蛋白质含量较高,不含可溶性多糖及淀粉粒,围绕在卵核及次生核周围的淀粉粒迅速消失,消耗的淀粉一方面水解作为能量的来源,另一方面为合子多糖性质的细胞壁的合成提供原料,合子PAS反应呈阳性[17].Label(1994)发现欧洲黑杨(P.nigra L.)受精前后子房内的ABA含量不变[40].
2　雄性不育
雄性不育是由于植株不能产生正常的花药、花粉或雄配子,表现形式有:不能形成正常的小孢子发生组织,小孢子发生异常,形成不完善、不能存活的、畸形或败育的花粉,花粉不能成熟或无萌发能力,花药不开裂.花粉发育的每个时期都可能发生败育.雄性不育是植物界中一种普遍现象,这方面的研究报道很多,但大多以农作物为研究对象,对树木雄性不育机理的研究不多.樊汝汶等(1992)认为中国鹅掌楸花粉败育是遗传因子造成的,导致小孢子母细胞不能正常启动减数分裂或减数分裂异常.
杨树雄性不育机理的研究主要停留在对形态结构的观察,尚未深入到分子遗传水平.目前认为,杨树雄性不育的原因主要是绒毡层发育异常.由于绒毡层是花粉粒发育时的营养来源,它的异常发育将导致绒毡层无法为花粉的发育提供适当的营养,使花粉处于饥饿状态.李文钿等(1982)在小叶杨中同时观察到绒毡层的早期败育和延迟败育,在出现早期败育的绒毡层花粉囊中可以看到败育的花粉母细胞不正常的减数分裂和败育的小孢子四分体;在绒毡层延迟退化的花粉囊中,往往有败育的粘连成片的空壳花粉和畸形的多核大花粉[13].董源(1982)认为毛白杨雄性不育是由于绒毡层过度增生抑制了花粉的发育,绒毡层异常通常发生在小孢子母细胞和四分体时期.败育的四分体无核或核不明显,染色极深[1],并认为低温能诱导雄性不育.康向阳(1996)则认为绒毡层的异常发育只是毛白杨雄性不育的一种表象,其根源在于毛白杨染色体的异源性,导致减数分裂时同源染色体不均衡分配[26].纤维层内壁和侧壁加厚,有利于失水后花粉囊的裂开和散粉,纤维层的加厚异常将导致花药不开裂[13].
3　种间杂交不亲和性
探索种间杂交不亲和性的原因,是植物生殖生物学中一个很重要的内容,为植物杂交育种工作的深入开展提供了条件.70年代以来,国内外针对杨树种间杂交不亲和性进行了大量的研究[12,19,47,51],揭示了一些种间杂交不亲和性的原因.如花粉萌发率很低[35,37],花粉2柱头不亲和,花粉管不能进入柱头12,32];花柱不亲和,花粉管无法达到子房[32,35];胚囊发育迟缓,花粉管无法进入胚囊[12];杂种胚乳发育不正常导致杂种胚死亡[12]等.不亲和性的表现主要有花粉及花粉管分泌物少,柱头表面和花粉管前端沉积胼胝质[32,41],花粉管在柱头上表现异常,扭曲、盘绕、爬行[19,41,55],柱头细胞提前解体[19],胚乳和胚败育[12,41,55]等.朱彤等(1989)认为柱头细胞的提取解体退化是雌蕊拒绝反应的一部分,表现为细胞质解体,细胞内部液泡化,膜结构逐渐消失以及细胞质电子密度增大.
花粉落到柱头上后,花粉2柱头间将发生主动识别反应[38],柱头一旦识别出了不亲和的花粉壁蛋
17
第6期张志毅等:杨树生殖生物学研究进展
白,通常在乳突细胞内迅速产生胼胝质阻止花粉管的继续侵入[32].Knox(1972)首次在杨树的种间杂交研究中提出了主动识别(positive recognition)的概念,他在美洲黑杨×银白杨的杂交中发现,银白杨花粉与美洲黑杨柱头不亲和是由于绒毡层组织合成的一种特异蛋白,授粉后被释放出来,与柱头上的特异蛋白进行相互识别,并产生一系列反应,从而决定了花粉管能否进入柱头实现受精[37].
花粉2柱头相互作用这一识别过程涉及多种酶系的活动,在花粉外壁识别蛋白中常见酯酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶和转移酶类等酶系活动,在柱头表膜中有非特异性酯酶、酸性磷酸酶及过氧化物酶等酶系活动[20,30].李文钿等(1990)首次在杨树中报道了柱头表膜A TP酶的活动,发现大叶杨柱头A TP 酶与花粉2柱头相互作用有一定相关性,A TP酶的活性随柱头可授期的到来而增加,幼嫩期和过盛花期的柱头薄膜上A TP酶活性低或没有[20].Villar (1993)发现亲和授粉后(欧洲黑杨×欧洲黑杨)β2半乳糖苷酶的活动上升,而在不亲和杂交组合中(欧洲黑杨×银白杨),β2半乳糖苷酶未表现活性上升,认为β2半乳糖苷酶在花粉管的异养生长中起重要作用,与花粉2柱头相互作用有关.Rougier(1988)在美洲黑杨×银白杨的不亲和杂交中发现,腺苷酸环化酶(CAMPase)的活性比亲和杂交的活性低,认为CAMPase与花粉在柱头上粘附、吸水及萌发有关,活性下降是配子体表型不亲和的细胞化学表现之一[45].G aude(1982)用血细胞凝集技术研究了欧美杨花粉外壁可扩散的细胞粘附分子(CAMS),推测CAMS可能是一种类外源凝集素,与花粉2柱头识别反应有关[34].总之,对这些酶类的研究为探讨不亲和性机理以及寻求克服方法提供了新的思路和途径.
杨树杂交中的单向不亲和性较为普遍,对于单向不亲和性的原因尚无一致意见.Villar et al (1987)认为欧洲黑杨×银白杨的单向不亲和性是由于两个种的柱头类型不同造成的,欧洲黑杨具有干柱头的特征,表面有一层薄膜,而银白杨是湿柱头,有丰富的分泌物[53].这与李文钿等(1995)的研究结果不同,李文钿认为杨树柱头都是湿型分泌柱头[15].
克服杂交不亲和性的方法很多,如花粉蒙导、用生理活性物质处理雌蕊、重复授粉、受精工程等.在杨树杂交中主要采用蒙导花粉授粉,使柱头不能识别不亲和的花粉,以克服种间杂交不亲和性,获得杂种[33,49,50].美国华盛顿大学的Stettler教授在这方面作了许多工作[49,50,51].4　生殖工程
目前,杨树生殖工程的研究主要是以子房、胚珠和花药离体培养为主,已成功地诱导出生长正常的植株.
杨树杂交胚胎学的研究表明,杨树一些种间杂交的障碍不是发生在受精之前,而是发生在受精之后,胚在发育过程中败育[12,14,41],因此利用子房和胚珠离体培养可以克服种间杂交胚的败育.迄今为止,利用子房和胚珠培养诱导植株成功的有:小叶杨×美杨,小叶杨×胡杨,小叶杨×大叶杨,欧洲黑杨×大叶杨,大叶杨,银白杨,欧洲黑杨,小黑杨(P.×si monigra Chon2Lin)等[7,29,39,44].李文钿等(1983)对不同发育阶段小叶杨×美杨杂种胚的胚珠进行离体培养,认为离体胚珠的最适接种时间是在大多数杂种胚尚未败育之前,胚龄越大,越容易成活[14].
70年代以来,相继成功地利用花药离体培养诱导出多种杨树花粉植株,有:小叶杨×美杨、小叶杨×黑杨、北京杨、中东杨、美杨、美杨×青杨、大青杨、欧洲黑杨、欧洲黑杨×小叶杨、银白杨×小叶杨、美杨×欧洲黑杨、箭杆杨(P.thevesti na Dode)×欧洲黑杨、胡杨等[8～10,22,42],并对花粉植株的倍性和育性进行了研究,杨树花粉植株一般是混倍体和非整倍体,随着树龄的增大,自行调整和加倍到二倍体[22,23].刘玉喜(1986〕发现9～10年生的小叶杨×欧洲黑杨花粉植株的花粉母细胞减数分裂正常,能产生有活力的成熟花粉,授粉后能产生饱满种子[23].一般认为杨树花粉愈伤组织的诱导以单核期接种最为适宜,有利于花粉进行异常分裂和形成多细胞花粉[9].离体培养条件下,雄核发育以均等分裂为主,非均等分裂和多核花粉类型较少,并很快解体[9].
5　结 语
纵观杨树生殖生物学研究发展情况,它已经形成了初步的理论体系,研究重点从单纯的形态描述转向对结构与功能关系的综合研究.70年代以来,应用电镜和细胞化学等生物新技术,研究探讨了杨树有性生殖过程中某些结构和生理功能的关系,诸如花粉壁和柱头表面的结构成分与花粉2柱头相互识别的关系,绒毡层细胞结构成分与雄性不育的关系等.同时,我们还应看到在杨树生殖生物学的研究中,还有许多急待解决的问题,如雄性不育的机理,受精作用中不亲和性的机制,配子体形成过程中的遗传控制机制和配子体的基因表达等.我们相信,随着对这些问题的深入了解和认识,对杨树有性生殖
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过程(传粉、受精和胚胎发生等)的完全控制将会成为现实,这必将会使杨树育种工作更紧密地朝着人类所期望的方向发展.
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(责任编辑　胡　涌)
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《北京林业大学学报》编辑部
2000111110 47北　京　林　业　大　学　学　报第22卷　。