动物组织胚胎学实验技术

固定的目的
固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生 质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来 的结构以供观察。
固定的作用
防止组织自溶和腐败 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存 下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活 时相近似的形态和结构 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不 同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况 下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还 有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易 于染色 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变 形，有利于操作
试剂和药品
甲醛、冰醋酸、浓盐酸、浓硫酸、氨水、甘 油、中性树胶、 95%酒精、100酒精、二 甲苯 苦味酸（2,4,6-三硝基苯酚）、伊红、铵 （钾）明矾、氧化汞 固体石蜡
实验材料
发育成熟的鱼类 发育至不同阶段的鱼类胚胎 动物组织
试剂的配制
梯度浓度酒精
95%酒精用量 酒精浓度（%） （ml） 50 50
动物胚胎发育观察
材料：鱼类 优点：体外 受精和发育 卵膜透明 发育时间短
操作步骤：取材、固定、洗涤
将动物杀死，剪开腹腔，依次取肝、肠等， 切成规则的小块或小段，用Bouin氏液固定， 大约30min后，取出置于滤纸上修整。固定 剂用量为材料块体积的10-15倍，一般固定 12-24h，中途可更换一次固定液 倒去固定液，用70%酒精洗涤数次
脱水
材料洗涤后，其中含水，水与石蜡不能混合， 必须洗去。脱水用酒精，由低度酒精渐至高 度酒精。通常由50％、70％、80％、90％， 95%、100%，每次须经半小时，材料大 的，时间须延长 若暂时不能埋蜡，材料可放在80％酒精中长 期保存 在高度酒精中，不能过久．因酒精能使材料 硬化，过久则材料由硬而脆，切时易于粉碎



折纸盒按下列顺序折叠
(1) 折AA'及BB'； (2) 折CC'及DD'； (3) 折CE'与AE'、向外夹出EE'。同样折出FF'，GG'及HH'； (4) 使CE'E与E'IE两三角形相叠，并沿E'C和EI重叠的折痕向 后转折。同样折其余三只角； (5)折EIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。
试剂的配制
水伊红：水溶液0.1—1% 酒精伊红：伊红1g，70-75%酒精100ml
1%（或0.5%）酸性水：浓盐酸1ml（0.5ml） +蒸馏水99ml（99.5ml） 碱性水：0.1%氨水或1%碳酸锂水溶液 蛋白甘油：将鸡蛋钻孔取蛋清于小烧杯中， 用细玻璃棒沿同一方向打成白色泡沫状，然 后加入等量甘油
伊红苏木精染色脱水透明胶封?脱水用酒精由低浓度酒精至高浓度酒精依次进行最后入纯酒精更换一次用二甲苯透明用树胶封片实验器具?染色缸广口瓶培养皿?毛笔吸水纸牛皮纸标签纸纱布?载玻片盖玻片玻棒?解剖工具双刃刀片解剖盘?天平?电炉酒精灯实验仪器?智能程控生物组织自动脱水机?生物组织自动包埋机?电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机?振动切片机?生物组织摊片烤片机?电脑自动染色机?体视显微图像电脑处理系统?高清晰显微图像电脑分析系统试剂和药品?甲醛冰醋酸浓盐酸浓硫酸氨水甘油中性树胶95酒精100酒精二甲苯?苦味酸246三硝基苯酚伊红铵钾明矾氧化汞?固体石蜡实验材料?发育成熟的鱼类?发育至不同阶段的鱼类胚胎?动物组织试剂的配制?梯度浓度酒精酒精浓度95酒精用量ml蒸馏水用量ml50504570702580801590905试剂的配制?bouin氏液
固定剂的种类：混合固定液：由几种药剂， 适量配制而成
Bouin氏液：是常用的良好固定液，广泛应用于一般 动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及 胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和 被子植物的胚囊的固定 此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬 变脆，着色良好。一般动物组织固定12—24h，小块 组织数小时即可。固定后直接入70％酒精中洗去黄色， 但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间 为12—48h
固定剂的特点
穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝 固，不发生任何变形 增强折光率，不妨碍染色
固定剂的种类：简单固定液：以一种化学 药品配制的固定液
酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时 间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存 液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精 为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋 白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。 福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固 定用的浓度为4-10％甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。 经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每 每出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用 醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。醋 酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2～5％，也常与其他固 定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常 与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此固定染色体的 固定液中，几乎都含有醋酸。
操作步骤
包埋 切片 展片和贴片
操作步骤：染色
将切片依次经过二甲苯（1015min）、二甲苯（10-15min）、 1/2二甲苯+1/2无水酒精（5min）、 100%酒精（2-3min）、95%酒精（23min）、90%酒精（2-3min）、80% 酒精（2-3min）、70%酒精（23min）、蒸馏水、苏木素（4560min）、自来水（返蓝为止）、酸 性水（数秒）、碱性水（或自来水） （返蓝为止）、蒸馏水、伊红水溶 液（3-5min）、70%酒精（2-3min）、 80%酒精（2-3min）、90%酒精（23min）、95%酒精（2-3min）、95% 酒精（2-3min）、100%酒精（23min）、100酒精（2-3min）、1/2 无水酒精+1/2二甲苯（3-5min）、 二甲苯（3-5min）、二甲苯（35min）
教学内容
动物胚胎发育观察：21学时（3天） 动物组织石蜡切片技术
实验前的准备：试剂、染料等配制，玻璃器皿等 清洗，石蜡熬制，3-4学时 动物组织块选取、固定、修整，3学时 组织块脱水、透明、石蜡包埋，6-7学时 组织块切片、染色、封片，6-7学时
制作好的组织学切片的观察、拍照，3-4学时
操作步骤：脱水、透明、透蜡
组织块依次经过70%， 80%，95%，95%， 100%，100%酒精 （45-60min），1/2 无水酒精+1/2二甲苯 （30-45min），二甲 苯（15-30min） 依次经过1/2二甲苯 +1/2石蜡（30min）， 石蜡（45-60min）， 石蜡（45-60min）
脱水、透明、胶封
脱水用酒精，由低浓度酒精至高浓度酒精依 次进行，最后入纯酒精更换一次，用二甲苯 透明，用树胶封片
实验器具
染色缸、广口瓶、培养皿 毛笔、吸水纸、牛皮纸、标签纸、纱布 载玻片、盖玻片、玻棒 解剖工具 、双刃刀片、解剖盘 天平 电炉、酒精灯
实验仪器
智能程控生物组织自动脱水机 生物组织自动包埋机 电脑快速恒冷冷冻、石蜡两用切片机 振动切片机 生物组织摊片、烤片机 电脑自动染色机 体视显微图像电脑处理系统 高清晰显微图像电脑分析系统
组织切片的形态计量技术，3-4学时
实验内容与方法
人工催产和授精，获得鱼类的受精卵，在解剖镜下 观察胚胎发育过程，用显微数码系统拍照。 取不同发育阶段的胚胎进行固定，以作为检测其器 官、系统组织学特征随发育过程而变化的材料。 石蜡切片法：是显微技术上最重要、最常用的一种 方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机 切片，可以切出很薄的切片。 全都过程包括：固定、洗涤、脱水、透明、包埋、 切片、贴片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱 水、透明、封片等。
石蜡熬制
选择旧蜡，加入部分新蜡（熔点52-55度） 反复熬制，并用纱布过滤杂质
操作步骤：人工催产
购买性成熟的鱼类 人工催产 人工授精
操作步骤：胚胎发育观察
在解剖镜下观察胚胎发育进程，描述各主要 器官、系统的出现时间及发育情况 根据组织学检测的需要，选取不同发育阶段 的胚胎，并用Bouin氏液固定，固定剂用量 为材料块体积的10-15倍，一般固定1224h，中途可更换一次固定液 倒去固定液，用70%酒精洗涤数次
蒸馏水用量 （ml） 45
70 80 90
70 80 90
25 15 5
试剂的配制
Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液：福尔马林：冰 醋酸=15：5：1 卡尔诺氏(Carnoy’s)固定液：100%酒精：氯仿： 冰醋酸=6：3：1 Harris苏木素：甲液：苏木素0.9g，100%酒精 10ml；乙液：铵（或钾）明矾20g，蒸馏水 200ml；后加入氧化汞（HgO）0.5g。配制时以 甲液+乙液加热煮沸后离开火焰缓缓加入氧化汞 用玻璃棒搅和移烧杯于冷水速冷，第二天过滤， 另加5%冰醋酸
切片
旋转切片机分三个部分，安装切片刀的部分，有调 节刀片斜度和固着刀片的螺旋；安装材料的部分， 也有螺旋可以调节材料的位置；操纵在旋转中向前 推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复 杂的部分 将冷凝的蜡块，切成方形的小块，粘固在小木头上 安装切片刀，调整刀的斜度 修整蜡块，刀片斜度调好后，将刀片移近蜡块，使 小蜡块的下边与刀锋平行，然后把它固定。只有平 整的蜡块，才能切出平整的蜡带 根据需要，调整切片的厚度 进行切片，将切出的蜡带，平展于木盒内以供粘片
脱蜡
切片烘干后，需将蜡脱去，才能染色，脱蜡 用二甲苯，再经酒精入水中，而后染色，其 顺序如下： 二甲苯→1/2 二甲苯十1/2无水酒精 →100%酒精→95％酒精→80％酒精→70 ％酒精→水→染色，各级约需5～10分钟
染色
染色的方法很多，视研究目的加以选择 H.E染色：伊红+苏木精染色
固定剂的种类：混合固定液
卡尔诺氏(Carnoy‘s)固定液 此液作组织细胞的固定，有极快的渗透力，固 定根尖和花药只需40-60分钟。固定后用95％ 酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70 ％酒精中保存
洗涤
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏， 必须用水或酒精洗去。用什么去洗，可根据三条原 则： 1．凡用水溶液配制的固定液，特别是含有铬酸、 重铬酸钾的固定液，一律用水洗 2．凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清 洗 3．如固定液中含有苦味酸，在70％酒清中停留稍 久时，可除去黄色。如用升汞固定的材料，在洗涤 时，须加碘液，可除去汞的结晶
展片、粘片、烤片
把蛋白甘油均匀地涂抹在干净的载玻璃片上 在玻片上加少量蒸馏水，再取切片置于玻片 上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材 料不现皱纹为度 或将切片漂在热水中，待其展开后，用玻片 从水中捞起，贴于其上 用滤纸吸去多余水分，将贴有切片的玻片放 在烤片板或温箱中，将切片烘干
动物组织胚胎学 综合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ实验
实验目的
了解动物的早期发育过程 掌握石蜡切片的操作方法 掌握永久装片的制作过程，为研究动物的 内部结构奠定基础 将经典的石蜡切片技术与其他新的技术方 法相结合，使组织学的观察研究从简单的 形态结构观察和定性描述转向准确、可靠 的定量分析组织切片的形态计量技术
脱酒精
材料脱水后，材料中全含酒精，酒精与蜡也 不能混合，仍须除去 脱酒精通常用二甲苯，先经纯酒精和二甲苯 混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、 二次才行。时间每次约半小时 二甲苯不仅脱去酒精，并且能使组织块透明
包埋
埋蜡是把材料封埋在石蜡里面，便于切片。一方面材料太小太软封在石蜡中， 石蜡硬度适中，靠石蜡支持，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不仅 材料外面包着蜡，材料内面所有空隙也都充满着蜡。这样，材料的各部分都 能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形 石蜡熔点通常在48～56℃这个范围内，以52℃的石蜡用得更多。在材料不 硬，天气不热时，宜用较低熔点的蜡。材料硬，天气热的情形下，宜用高熔 点的蜡 材料要进行浸蜡，再进行埋蜡。一般先经过石蜡和二甲苯的混合液，再经过 两次纯石蜡，每次的时间，视材料大小而定，通常每次半小时，材料大，时 间必须加长 浸蜡后，将材料封埋在蜡块中，通常以牛皮纸折成纸盒。把蜡倒入盒内，将 材料移入纸盒中，以两手平持纸盒，移至冷水中，用口在蜡面上吹气，促其 凝结，待蜡面凝成簿层时，将纸盒全部沉入。水冷凝后，将纸撕去，获蜡块， 完成组织块的包埋