实验十二 反相高效液相色谱法分析尼泊金乙酯综述

实验十二反相高效液相色谱法分析尼泊金乙酯
预习提示
1.液相色谱仪的基本结构及操作技术
2.什么是反相液相色谱，反相高效液相色谱的分离特点是什么。

3.色谱分析外标定量法的操作要点。

一、目的要求
1.熟悉高效液相色谱仪器操作技术；
2.掌握HPLC保留值定性方法和外表定量方法。

（了解定制报告编辑方法）。

二、基本原理
尼泊金酯（对羟基苯甲酸酯）混合物中含有尼泊金甲、乙、丙、丁酯，均属于强极性化合物，可用反相HPLC进行分析，选用非极性的C18烷基键合固定相，甲醇水溶液作流动相。

外标定量法：配制系列标准浓度溶液，在一定色谱条件下进样得到对应的色谱峰面积，绘制标准曲线；在相同色谱条件下进样测得试样中被测组分色谱峰面积，据此在标准曲线上得到被测组分含量。

三、仪器、试剂
1.恒流泵Series Ⅲ
2. 500型紫外检测器
3. 高压六通进样阀（20ul）
4.分析之星色谱数据工作站
5.超声波发生器、过滤器
6.进样器1ml
7.10ug/ml对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯甲醇溶液；备测试样。

四、实验条件
1.色谱柱：250mm×4.6mm i.d 固定相：C18烷基键合相5um
2.流动相：甲醇：水（85：15）1ml/min
3.检测器：紫外光度监测器，254nm，灵敏度0.02
4.进样量20ul
五、实验步骤
1.将过滤配好的85％甲醇开盖置于超声波发生器脱器15min。

2.按仪器操作规程打开数据工作站，据给定仪器条件启动HPLC至基线平直。

3.用甲醇清洗进样注射器、进样阀（10ml容量瓶取甲醇适量，用干净的1ml注射器操作）。

4.取干净10ml 容量瓶5只，分别取10ug/ml的对羟基苯甲酸乙酯-甲醇标准溶液配制系列标准
溶液：
以85%甲醇稀释至标线。

5.用干净的1ml注射器取样0.4～0.6ml，排气泡，加过滤头，注入进样阀（LOAD位），接着
按仪器操作规程“10”进样操作。

待试样出峰完毕，积分后记录被测组分峰面积A i（每样进三次以便取平均值）。

6.以上述相同方法进被测试样分析，取5次以上A i平均结果。

7.实验完毕按仪器操作规程停机。

六、数据处理
1.据实验记录数据绘制标准曲线（用坐标纸或Microsoft Office Excel处理）并求得标准曲线方程、相关系数。

2.测定结果经统计处理列表：
七、思考题
1.液相色谱仪的主要部件有哪些？试画出HPLC流程方框图。

2.什么是反相液相色谱？按极性，化合物流出顺序如何？
3.液相色谱操作应注意哪些问题？
实验数据记录表（参考）
1.标准系列测定记录表
2.试样分析记录表。