α1抗胰蛋白酶突变体ATZ过表达增强细胞自噬水平

α1抗胰蛋白酶突变体ATZ过表达增强细胞自噬水平
朱娜;冯利杰;王海萍;沈玉君;沈玉先
【摘要】目的：观察α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）Z型突变体（α1-antitrypsin Z variant，ATZ）表达对细胞自噬水平的影响，探讨ATZ细胞毒作用的可能机制。

方法体外培养人胚肾细胞株HEK 293T并转染ATZ真核表达质粒，利用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达，免疫荧光染色观察LC3的细胞定位，real-time PCR法检测自噬相关基因Atg5、Atg12和Beclin1的变化，DAB染色观察ATZ过表达对细胞形态的影响。

结果与转染空质粒对照组相比，%Aim To investigate the effect of α1-anti-trypsin Z variant (ATZ)overexpression on cell autoph-agy.Methods HEK 293T cells were transfected with pcDNA3.1 zeo+/ATM or pcDNA3.1 zeo+/ATZ,e-qual amount of empty vector was used as control.Cells were treated with NH4Cl for 4 hours and processed for detecting ATZ,LC3 and p62 by immunoblot.Mean-while ,expression and intracellular localization of ATZ, LC3 in 293 T cells were observed with double labeled immunofluorescence.The mRNA levels of autophagy-related genes were measured by real-time PCR.Immu-nohistochemistry was used to observe the morphology of ATZ-positive cells.Results Compared with the control,higher LC3Ⅱ levels and LC3 puncta were ob served in ATZ transfected cells.Meanwhile,the levelsof p62 were decreased in ATZ transfected cells,andreversed by NH4 Cl (25 mmol·L -
1 )treatment.Over expression of ATZ increased the mRNA levels of
Atg5and Atg12,but had no obvious influence on
Beclin1.ATZ overexpressing cells presented abnormal
morphol ogies.The nuclei became reduced,condensed,and e ven disappeared in ATZ positive cells.Conclusion ATZ overexpression increases autophagy activity whichmay be related to increasing Atg5 and Atg12 levels.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】5页(P921-925)
【关键词】α1 抗胰蛋白酶 Z 型突变体;自噬;p62;LC3;Bec-lin1;细胞毒性
【作者】朱娜;冯利杰;王海萍;沈玉君;沈玉先
【作者单位】安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥 230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032;安徽医科大学基础医学院，安徽合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，安徽合肥 230032
【正文语种】中文
【中图分类】R329.24;R329.25;R345.3;R394.2;R977.3;R977.6
α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）属于丝氨酸蛋白酶超家族成员，由肝细胞合成和分泌，可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多种蛋白酶活性，但
其主要作用是通过血液循环扩散到肺部，保护肺组织弹力纤维免受中性粒细胞弹性蛋白酶的水解和破坏［1］。

AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，由于编码AAT蛋白的基因突变而引起AAT分泌障碍所致，其中最常见的突变为Z型突变，该突变编码的蛋白为AAT Z突变体（α1-antitrypsin Z variant，ATZ）。

AAT缺乏症最典型的临床表现为早发性肝脏疾病和肺气肿［2－3］。

其中，AAT缺乏症
肝脏疾病主要是由于ATZ蛋白在肝细胞内聚集造成的细胞毒性引起。

我们的前期
研究已发现ATZ具有细胞毒性，但其细胞毒作用的确切机制还不清楚。

自噬是普
遍存在于真核细胞中的一种保守的蛋白质降解途径，细胞利用溶酶体降解自身细胞器和大分子物质，实行“自我消化”，在营养缺乏、氧化应激、缺氧等条件下对细胞具有一定程度的保护作用；但是，过度激活的自噬也会引起细胞的损伤，甚至细胞死亡［4］。

研究发现，引起细胞毒性的ATZ聚集体部分会被自噬体包裹并降解，而对于自噬在过表达ATZ所引起的细胞毒性过程中是否发挥着一定的作用尚不清
楚［5］。

本研究通过在293T细胞中过表达ATZ蛋白，检测细胞自噬相关基因和蛋白表达及自噬体的形成，观察ATZ对自噬活性和细胞形态的影响，从而为其细
胞毒性作用提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 试剂及抗体 DMEM高糖培养基，Opti-MEM，Lipofectamine 2000购自Gibco公司，小牛血清（fatal bovine serum，FBS）购自杭州四季青公司，预染蛋白分子量Marker购自Fermentas公司，PVDF膜为GE公司产品，ECL发光
试剂盒购自Pierce公司，NH4 Cl购自上海生工产品，p62、LC3、α-tubulin多
克隆抗体购自Sigma公司，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG（H＋L）和Alexa Fluor 350 donkey anti-goat IgG（H＋L）购自Invitrogen公司，DAB显色试剂盒购自中衫金桥公司，SYBR Premix EX Tag购自宝生生物工程（大连）有限公司。

1.2.1 质粒转染 293T细胞按5×105个细胞/孔接种于6孔板，在5%CO2 37℃恒温培养箱中培养，直至转染前细胞密度达到80%～90%；质粒转染采用Lipofectamine 2000，操作方法按试剂说明书进行，转染后的细胞在含5%CO2 37℃恒温培养箱中培养6 h后，更换培养液。

1.2.2 细胞免疫荧光染色和DAB染色接种于24孔板的细胞去除培养液，4%多聚甲醛4℃固定10 min，PBS洗5 min×3次，用含1.0 g·L－1牛血清白蛋白和1.0 g·L－1皂素的PBS于4℃透膜封闭处理0.5 h，加入DAB染色的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，依次加SP试剂盒中的B，C液，DAB显色；PBS洗5 min×3次后加入适当稀释度的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，加入适当稀释度的荧光二抗37℃避光孵育1 h，DAPI（5 mg·L－1）孵育10 min衬染核，PBS洗5 min×3次，共聚焦显微镜或荧光显微镜采集图片。

1.2.3 蛋白质免疫印迹收集6孔板中转染后的细胞，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，100℃变性15 min。

SDS-PAGE凝胶电泳后湿转至PVDF膜。

用含0.5 g·L－1脱脂奶粉的PBST封闭30 min后，加入适当稀释度的一抗室温孵育2 h，PBST洗10 min×3次，加入适当稀释度的二抗室温结合1 h，PBST洗10 min×3次，ECL显影。

1.2.4 real-time PCR 反应总体积10μl，SYBR Premix Ex Taq 5μl，cDNA模板
1μl，双蒸水3.2μl，引物0.8μl，反应条件为：94℃变性2 min，94℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸20 s，45个循环。

Beclin1上游引物：5′-CAA GATCCTGGACCGTGTCA-3′，下游引物：3′-TGGCACTTTCTGTGGACATCA-5′；Atg5上游引物：5′-AGAATAGCCAGTACAGCA-3′，下游引物：3′-ATGAA CCGACGAATAAAC-5′；Atg12上游引物：5′-GCGAACACGAACCATCCA-3′，下游引物：3′-CCACGCCTGAGACTTGCA-5′。

2．1 ATZ表达对自噬相关蛋白LC3和p62表达的影响为了检测ATZ表达对细胞自噬的影响，我们观察了自噬相关蛋白：微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和p62的表达。

结果发现，转染表达正常AAT蛋白质粒（pcDNA3.1-zeo＋-ATM）的细胞相比，ATM（alpha1-antitrypsin M phenotype）为正常活性 AAT，转染Z型突变体质粒
（pcDNA3.1zeo＋-ATZ）的细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ增加，提示ATZ能增加自噬体形
成（Fig 1）；同时转染ATZ的细胞中p62水平明显降低，而溶酶体抑制剂氯化
铵（25 mmol·L－1）作用4 h能增加p62水平（Fig 1），提示ATZ增加细胞自噬水平，增加p62降解。

2．2 ATZ表达对细胞自噬体形成的影响同上转染细胞，并用氯化铵抑制溶酶体降解功能，免疫荧光双标结果显示，ATZ表达少的细胞中LC3弥散在胞质中（Fig 2，细箭头所示）；而ATZ表达多的细胞中可以看到大量LC3的点状聚集（Fig 2，粗箭头所示），并且与ATZ共定位，提示ATZ能促进细胞内自噬体的形成。

Fig 1 ATZ overexpression increases LC3-Ⅱ/Ⅰand facilitates p62 degradationA：293T cellswere transfected as indicated.24 hours after transfection，cells were treated either with DMSO（lane 1，2，3）or NH4 Cl（lane4，5，6）for4 hours.Cellswere harvested and processed for detecting ATZ，p62 and LC3.α-tubulin was used as loading control.B：Quantitative data from A were shown as the±s and represented three independent experiments.*P＜0.05 vs the vector control.
2．3 ATZ表达对细胞自噬相关基因的影响为了进一步了解ATZ对细胞自噬水平
的影响，我们观察了自噬关键基因Atg5、Atg12和Beclin1的表达。

与转染空质粒的细胞相比，过表达ATZ的细胞中Atg5和Atg12的mRNA水平明显增加
（Fig3 A，B），而对Beclin1水平无明显影响（Fig 3C）。

2．4 ATZ诱导的自噬水平增加对细胞形态的影响
为了观察ATZ诱导的细胞自噬水平增加对细胞形态的影响，我们同上转染细胞，
用免疫细胞染色法检测表达ATZ细胞的形态和LC3水平。

结果发现，在少量表达ATZ的细胞中，细胞及细胞核形态趋向正常，LC3表达增加，呈点状聚集在胞质中；ATZ表达高的细胞体积较小或偏圆，细胞核变小、致密或淡染、碎裂甚至消失，破碎；胞质中无 LC3表达（Fig 4）。

3 讨论
AAT是体内重要的蛋白酶抑制物，能抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、胶
原酶、纤溶酶、尿激酶等多种蛋白酶，其缺乏可引起系统性脉管炎、坏死性脂膜炎、肝脏以及肺部疾病。

肝脏疾病包括肝炎、肝硬化和肝癌是AAT缺乏症患者尤其是
肝细胞内有AAT多聚体患者明显的临床表现［6］。

自噬是一个调控细胞内容物
的降解和再循环的过程，通过参与细胞器的代谢、降解以及再利用等维持正常细胞功能。

其特征是首先在细胞质中形成月牙形的膜结构，包裹待降解物质后形成的泡状结构称为自噬体，随后自噬体与溶酶体发生融合，自噬所包裹着的待降解物质进入溶酶体中被降解。

自噬作为一种细胞生存的机制，在很多生理过程如抵抗营养缺乏、清除损坏的细胞器、降解细胞内异常蛋白质中发挥重要作用［7］；然而过度的自噬则会形成自噬应激，损伤细胞器，如造成线粒体功能障碍等，从而产生细胞毒性。

Fig 2 ATZ co-localizeswith LC3 and increases LC3 puncta after autophagy inhibition by NH 4 Cl293T cellswere transfected with pcDNA3.1 zeo＋
/ATZ.NH4 Cl（25mmol·L－1）wasadded to themedium 24 hours after transfection.Four hours later，cells were fixed and subjected to double labeled immunofluorescence withmonoclonal anti-ATZ（blue）and
polyclonal anti-LC3（green）antibodies.C and F weremerged images taken under confocalmicroscope.Scale bar＝25μm.
Fig 3 ATZ overexpression increases themRNA levels of Atg5 and Atg12±s）293T cells were transfected with vector and pcDNA3.1 zeo＋/ATZ.Twenty-four hours after transfection，cells were harvested.Total RNA was extracted and relativemRNA levelsweremeasured by real-time PCR.A：relative Atg5mRNA level，**P＜0.01 vs vector.B：relative Atg12 mRNA level，*P＜0.05 vs vector.C：relative Beclin1 mRNA level，P＞0.05 vs vector.
Fig 4 Effect of ATZ expression on cellmorphologies293T cells were transfected with pcDNA3.1 zeo＋/ATZ.Twenty-four hours after transfection，cellswere fixed and stained withmonoclonal anti-ATZ（yellow），polyclonal anti-LC3（green）and DAPI（blue）.D and H weremerged images.Scale bar＝20μm.
为了探究ATZ细胞毒性是否与诱导细胞自噬有关，我们在293T细胞中过表达ATZ，观察LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以及p62水平。

LC3是自噬体膜标志性蛋白，
有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种亚型；自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-Ⅰ）会酶解掉
一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-Ⅱ），因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大
小可估计自噬水平的高低。

p62是一个自身可通过自噬特异性降解的多功能蛋白，p62水平降低在一定程度上反映了自噬水平的增加。

我们的结果显示，过表达
ATZ细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62水平降低，而氯化铵抑制自噬后p62水平
恢复，提示ATZ能增加细胞自噬。

为了更直观的反映ATZ对细胞自噬体形成的影响，我们采用氯化铵抑制溶酶体活性，利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现
象观察ATZ对自噬体数量的影响，结果发现过表达ATZ后 LC3点状聚集明显增
加［8］，提示ATZ能促进细胞内自噬体形成。

通常情况下，细胞自噬的发生依赖于一系列Atg家族蛋白，其中 Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，通过与ClassⅢPI3K形成复合物参与自噬体初期自噬体膜的形成［9］；另外，Atg5在细胞内形成Atg12-Atg5复合物，能促使LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转变，对自噬体膜的延伸至关重要［10］。

Q-PCR结
果显示，过表达 ATZ细胞内自噬相关基因Atg5和Atg12的mRNA水平明显升高，而对Beclin1的mRNA水平无明显影响。

因此我们猜测，过表达ATZ可能通过作用Atg5-Atg12复合物参与自噬体膜延伸环节而非自噬体膜初期形成阶段。

另外，我们发现表达ATZ的细胞自噬活性的增加，但ATZ过度表达的细胞形态明显异常，核分叶、固缩、碎裂或消失，这与我们前期结果一致［11］。

综上所述，细胞自噬在过表达ATZ的细胞模型中可能发挥着双重作用；一方面，
在早期阶段自噬的诱导加速了蛋白聚集体的清除，对细胞起保护作用；另一方面，蛋白聚集体因细胞自噬活性改变而不能有效降解，最终会导致细胞毒性。

过表达ATZ可能通过影响Atg5-Atg12复合物影响自噬，至于确切的作用机制还需进一
步的实验证实。

参考文献：
［1］Lomas D A，Mahadeva R.α1-antitrypsin polymerization and the serpinopathies：pathobiology and prospects for therapy［J］.JClin Invest，2002，110（11）：1585－90.
［2］Trapnell B C，Luisetti M.The parallel lives of alpha1-antitrypsin deficiency and pulmonary alveolar proteinosis［J］.Orphanet J Rare Dis，2013，8（1）：153.
［3］Rudnick D A，Perlmutter D H.Alpha-1-antitrypsin deficiency：A new paradigm for hepatocellular carcinoma in genetic liver disease
［J］.Hepatology，2005，42（3）：514－21.
［4］Sumpter R Jr，Levine B.Selective autophagy and viruses
［J］.Autophagy，2011，7（3）：260－5.
［5］Kamimoto T，Shoji S，Yoshimori T，etal.Intracellular inclusions containing mutantα1-antitrypsin Z are propagated in the absence of autophagic activity［J］.JBiol Chem，2006，281（7）：4467－76.
［6］Lomas D A，Evans D L，Finch JT，Carrell RW.Themechanism of Z alpha 1-antitrypsin accumulation in the liver［J］.Nature，1992，357（6379）：605－7.
［7］Levine B，Mizushima N，Virgin HW.Autophagy in immunity and inflammation［J］.Nature，2011，469（7330）：323－35.
［8］陈菊英，刘朝纯，朱邦豪，等.紫草素通过PI3K/Akt通路促进人乳腺癌MCF 细胞自噬［J］.中国药理学通报，2013，29（2）：194－8.
［8］Chen JY，Liu Z C，Zhu B H.Shikonin promotes autophagy of MCF-7 human breast cancer cells through PI3K/Akt pathway［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：194－8.
［9］Petiot A，Pattingre S，Codogno P，et al.Diversity of signaling controls ofmacroautophagy in mammalian cells［J］.Cell Struct Funct，2002，27（6）：431－41.
［10］Nontasut P，Singhasivanon V，Setasuban P，etal.Effectof singledose albendazole and singledosemebendazole on Necator americanus［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，1989，20（2）：237－42.
［11］王海萍，王法财，沈玉先.GFP-ATZ在HEK 293T中的表达及其细胞毒作用
［J］.安徽医科大学学报，2010，45（6）：733－4.
［11］Wang H P，Wang FC，Shen Y X.Eukaryotic expression of GFPATZ and its toxic effect to HEK 293T cells［J］.Acta Univ Med Anhui，2010，45（6）：733－4.。