喷雾干燥细菌素的生物学活性研究

喷雾干燥细菌素的生物学活性研究
卫旭彪;武如娟;郑召君;马广;廖秀冬;张日俊
【摘要】为了初步研究前期试验筛选获得的枯草芽孢杆菌产细菌素的生物学活性,本试验采用杯碟扩散法绘制出硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌两种抗生素的抑菌效价标准曲线,用抗生素效价当量来评价细菌素的活性,并在不同温度处理下测定其抗菌活性和热稳定性.结果表明,125 mg/mL细菌素溶液抑菌效价与26 mg/mL硫酸黏杆菌素或11.9 mg/mL杆菌肽锌溶液相当.此外,该细菌素在高温条件下(60～80℃)处理15 min仍能维持较高抑菌活性.综上所述,本试验在细菌素和抗生素的抑菌活力之间建立了更直观的联系,并证明了该细菌素具有较好的热稳定特性,为其产业化推广提供了理论支持和技术借鉴.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)012
【总页数】6页(P3268-3273)
【关键词】细菌素;抗生素;抑菌活力;热稳定性
【作者】卫旭彪;武如娟;郑召君;马广;廖秀冬;张日俊
【作者单位】中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京
100193;中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京100193
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
细菌素是由一些细菌通过核糖体代谢途径产生的具有抗菌作用的多肽或蛋白质，可抑制病原微生物(如大肠杆菌、沙门氏菌等)生长[1-2]，是一种潜在的抗生素高效替代品。

国内外学者对细菌素的抑菌特性和抗菌机理等方面进行了大量的研究。

胡婷等[3]和李振森等[4]分别发现枯草芽孢杆菌MA139类细菌素和解淀粉芽胞杆菌Y-32-1细菌素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原菌的生长有很强的抑制作用。

Mendo等[5]曾对地衣芽孢杆菌的纯化及其部分性质进行了研究，也发现了类似的抗菌结果。

与传统抗菌药物抗生素相比，细菌素具有安全无毒、无副作用、无残留、无抗药性等优点[6-7]，具有开发成新型生物兽药的潜力，市场应用前景广阔，但
当前有关细菌素替代抗生素的可行性和有效性的研究报道甚少，缺乏必要的数据支持。

饲料加工需要经过粉碎和制粒等工艺，期间会有一个短暂的80 ℃左右的高温过程[8]，不可避免地会造成蛋白质活性的损失。

细菌素是替代抗生素作为饲料添
加剂的一种优良选择，因此对其进行热稳定性研究具有重大意义。

中国农业大学饲料生物技术实验室通过前期筛选获得了一株高产细菌素的枯草芽孢杆菌LFB112，将其发酵液纯化后经喷雾干燥处理获得细菌素粉，为了研究该细菌素的抗菌活力，本试验尝试在细菌素和抗生素的抗菌效价之间建立直观的联系，即用抗生素的效价当量来评价细菌素的抑菌活性，从而为细菌素替代抗生素应用于畜牧生产提供理论支持，也为后续的动物药效试验提供参考，方便评价细菌素和抗生素的药效结果。

1.1 材料
硫酸黏杆菌素(纯度15%，4 500 U/mg)、杆菌肽锌(纯度15%，45 U/mg)均购自天津市新星兽药厂。

BPY培养基(1 L)：牛肉膏5 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，pH 7.0，若配成固体培养基，加琼脂1.8%，即18 g。

细菌素(枯草芽孢杆菌LFB112发酵液经喷雾干燥及后续工艺处理得到的细菌素粉)由中国农业大学饲料生物技术实验室提供。

菌悬液：取过夜培养的金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)1 mL，用无菌生理盐水以10倍稀释法制成107 CFU/mL的菌悬液，作为指示菌平板涂布液。

1.2 方法
1.2.1 指示菌检测琼脂平板制作取0.1 mL指示菌悬液滴在BPY培养基(琼脂含量1.8%)平板上，用已灭菌的棉棒将菌悬液均匀地涂布在平板上，待用。

根据扩散定律(抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方呈线性关系)测定样品效价。

1.2.2 抗生素抑菌效价测定配制浓度为2.5×104(B)、5.0×104(C)、1.0×105(A)、
2.0×105(D)、4.0×105(E)、8.0×105(F)U/mL 6个浓度梯度的硫酸黏杆菌素标准
溶液，其中1.0×105 U/mL(A)为参比浓度，用于其他标准浓度的校正，平衡平板
间的误差。

每个平板等距放入4个牛津杯，共5组(图1)，每组做3个平板重复，每个牛津杯加入对应编号浓度的细菌素溶液0.15 mL，37 ℃培养16 h后，精确测量各抑菌
圈的直径。

5组所有参比浓度A的硫酸黏杆菌素抑菌圈直径的平均值为r’，r’
与每组A硫酸黏杆菌素抑菌圈直径平均值的差值即为校正值a，每组的梯度标准
硫酸黏杆菌素溶液浓度的直径R加上a再平方，即为标准曲线的横坐标x。

计算公式即为：a=r’-r，x=(R+a)2。

移去牛津杯，精确地测量各浓度的硫酸黏杆菌素的抑制圈直径并记录；在对数坐标纸上，以抗生素浓度对数值为纵坐标y，以抑制圈直径校正值的平方为横坐标x，绘制标准曲线。

同理，配制浓度为43.8(B)、87.5(C)、175(A)、350(D)、700(E)、1 400(F) U/mL
的杆菌肽锌标准溶液，其中175 U/mL(A)为参比浓度，用于其他标准浓度的校正。

类似硫酸黏杆菌素同时做5组，每组3个重复。

用同样的方法绘制杆菌肽锌的标
准曲线。

1.2.3 喷雾干燥细菌素抑菌效价测定取喷雾干燥细菌素10 g，溶于80 mL灭菌生理盐水中，得到125 mg/mL细菌素溶液。

取3个平板，每个平板放4个牛津杯，间隔的2个加入1.0×105 U/mL的硫酸黏杆菌素(或杆菌肽锌，175 U/mL)标准溶液0.15 mL，另外2个空的牛津杯加入等
量待测样品，37 ℃培养16 h后，精确测量每个抑菌圈直径，分别求出硫酸黏杆
菌素(或杆菌肽锌)和细菌素溶液的抑菌圈直径的平均值，然后按1.2.2中标准曲线
的制备方法，求出待测样品的校正后直径、样品效价及与硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌之间的当量关系，计算公式为：硫酸黏杆菌素：y=0.0022x+3.9296；杆菌肽锌：y=0.0039x+0.8267，式中，y，抗生素浓度对数值；x，抑制圈直径校正值的平方。

1.2.4 喷雾干燥细菌素热稳定性测定取4份细菌素样品分别在40、60、80、
100 ℃下处理15 min，冷却后重新溶解于灭菌生理盐水中，配制与前面相同浓度的细菌素溶液。

将常温(25 ℃)时的活性设为100%，测定不同温度下的相对活性。

经过不同温度热处理后的样品抑菌活力测定方法及使用指示菌同1.2.3。

2.1 抗生素效价测定结果
2.1.1 抗生素抑菌圈直径采用杯碟法测定不同浓度梯度的抗生素(硫酸黏杆菌素和
杆菌肽锌)溶液抑菌活性，37 ℃培养16 h后测定其抑菌圈直径，结果见表1。

由
表1可知，硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌均对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。

在
浓度为2.5×104 U/mL时，硫酸黏杆菌素溶液的抑菌圈直径最小(14.7 mm)，而
后随其浓度的递增抑菌效果加强，在浓度为8.0×105 U/mL时获得最大抑菌圈(29.7 mm)。

杆菌肽锌的抑菌效果与硫酸黏杆菌素相似，在其浓度为1 400 U/mL 时获得最大抑菌圈(24.2 mm)。

2.1.2 抗生素抑菌效价的标准曲线在对数坐标纸上，以抗生素效价对数值为纵坐标，以测得的抑菌圈直径校正值的平方为横坐标，分别绘制两种抗生素抑菌效价的标准曲线，结果见图2。

由图2可知，硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌的标准曲线的相关系数R2分别为0.9932和0.9905，线性关系良好，拟合度较高，可应用于后续试验。

2.2 喷雾干燥细菌素与抗生素抑菌效价的当量关系2.2.1 喷雾干燥细菌素与硫酸黏
杆菌素抑菌效价的当量关系利用杯碟法比较细菌素溶液(125 mg/mL)和参比浓度的硫酸黏杆菌素的抑菌效果见图3。

由图3可知，细菌素溶液和硫酸黏杆菌素溶液均对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用，测得细菌素抑菌圈直径校正值为22.7 mm，将其代入硫酸黏杆菌素标准曲线对应方程可知，蛋白浓度为125 mg/mL的细菌素溶液的抑菌效价与26 mg/mL的硫酸黏杆菌素相当。

2.2.2 喷雾干燥细菌素与杆菌肽锌抑菌效价的当量关系由图4可知，细菌素溶液(125 mg/mL)和参比浓度的杆菌肽锌溶液均对金黄色葡萄球菌产生明显的抑制作用。

测得细菌素抑菌圈直径校正值为21.2 mm，将其代入杆菌肽锌的标准曲线对
应方程可知，蛋白浓度为125 mg/mL的细菌素溶液抑菌效价与11.9 mg/mL的
杆菌肽锌相当。

2.3 喷雾干燥细菌素热稳定性
细菌素经过40～100 ℃温度处理15 min后，观测其对金黄色葡萄球菌抑菌效果，结果见图5。

由图5可知，温度为40与60 ℃时可以保持100%的抑菌活性，80 ℃时仍保持约80%的抑菌效果。

而100 ℃高温处理后，细菌素活性会快速下降到27%。

说明高温对该细菌素活性有一定程度的影响，但整体而言，在非极端温度
环境(低于100 ℃)中该细菌素仍可以维持较高的抑菌活性(表2)。

由此可见，该细
菌素具有较好的温度耐受性，在不同的温度环境中具有较高的稳定性。

3.1 喷雾干燥细菌素与抗生素的当量关系
在以往的细菌素和抗菌肽研究中，比较常用的是直接通过琼脂扩散法测定不同浓度的细菌素或抗菌肽的抑菌活力。

王庆伟[9]利用这种方法研究了细菌素Sublancin 对金黄色葡萄球菌CVCC1882和ATCC43300的抑菌作用，发现其对这两种菌都有良好的抑菌作用。

栾超[10]通过琼脂扩散方法研究了重组表达抗菌肽cathelicidin-BF的抑菌特性，发现其与化学合成形式的抗菌肽抑菌活性相当。

当然，这种方法也可以用于LFB112菌株所产的细菌素活性测定。

然而，在之前的LFB112研究中发现，其所产的细菌素能够被蛋白酶K和蛋白酶E降解，是属于蛋白或多肽类的抗生素，同时其所产的抗菌物质能够抑制革兰氏阳性、革兰氏阴性病原菌，但是对于肠道益生菌如双歧杆菌并无抑制作用[11]。

由于LFB112抗菌物质的蛋白特性，其可被蛋白酶降解，这就避免了日后应用时抗菌物质的残留问题。

因此，可以将LFB112所产的细菌素开发为新型的生物兽药，这就有必要将其与抗生素的活性进行对比，更直观地比较两者间的活性差别，为以后动物性安全试验的添加剂量确定提供依据。

传统的抑菌活力测定方法都是以细菌素自身的不同浓度为参照而定义，并没有涉及其他抗生素参照。

因此，本试验采用经典的硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌作为参照物，其主要原因在于，二者和细菌素的敏感指示菌均为金黄色葡萄球菌，便于直观地揭示抗生素及LFB112细菌素的活性差异。

本试验利用琼脂扩散法中的杯碟法绘制了硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌两种抗生素的效价标准曲线，分别为：y=0.0022x+3.9296(R2=0.9932)；
y=0.0039x+0.8267(R2=0.9905)。

建立了以硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌标准曲线为参照的细菌素活性评价新方法，其相关系数都在0.99以上，测定结果稳定、准确度高。

试验结果表明，125 mg/mL细菌素抗菌效价与26 mg/mL的硫酸黏杆菌素或11.9 mg/mL的杆菌肽锌相当。

陈香等[12]研究发现用250 mg/kg天蚕素抗菌肽取代断奶仔猪日粮中的20 mg/kg硫酸黏杆菌素和100 mg/kg杆菌肽锌，断奶仔
猪腹泻率会显著降低，饲料转化效率显著提高。

任建波等[13]发现，在断奶仔猪日粮中添加400 mg/kg天蚕素抗菌肽替代40 mg/kg杆菌肽锌时，其生长性能未受明显影响。

与上述天蚕素抗菌肽作用效果相比，本试验细菌素单位质量的抗菌活性还不够理想。

如果想要成为抗生素的高效替代品并进行工业化生产，还需对生产这种细菌素的枯草芽孢杆菌LFB112进行基因改造，并对细菌素做进一步的纯化，纯化后细菌素的抗菌效价会更高。

因此，通过喷雾干燥得到的这种细菌素应用前景光明，有较大潜力。

3.2 温度对细菌素抑菌活力的影响
试验细菌素是由中国农业大学饲料生物技术实验室前期筛选获得的枯草芽孢杆菌LFB112发酵液通过喷雾干燥工艺处理得到，操作温度采用进风120～135 ℃，出风70～80 ℃。

相关研究表明[14-16]，枯草芽孢杆菌及其发酵液通常采用的喷雾干燥工艺为：进风温度150～170 ℃，出风温度70～90 ℃，在此过程中会导致菌体存活率及发酵液喷雾粉剂活性的降低。

由本试验结果可知，经喷雾干燥处理后得到的细菌素溶液仍具有良好的抑菌活性，说明该细菌素具有良好的温度耐受性。

该细菌素在非极端温度环境(低于100 ℃)中仍可以维持较好的抑菌活性，说明该细菌素具有良好的热稳定性，基本可以承受饲料制粒等生产过程中80 ℃左右的高温[17]。

如果还需要经过更高温度的特殊加工处理，则可以通过喷涂、包被等保护措施增加其稳定性[18-19]或采用后添加工艺[20]。

这些特性使得该细菌素在生物兽药或饲料添加剂方面具有较高应用价值，具有替代抗生素的巨大潜力。

本试验结果表明，试验细菌素具有一定的抑菌作用，蛋白浓度为125 mg/mL细菌素抗菌效价与26 mg/mL的硫酸黏杆菌素或11.9 mg/mL的杆菌肽锌相当。

该细菌素也有较好的热稳定性，在80 ℃时仍可以维持接近80%的抑菌活性。

如果将该枯草芽孢杆菌进行一定的基因改造并对所产细菌素进行浓缩、纯化等处理，能够得到具有更高单位质量抑菌效价的细菌素，从而作为抗生素的高效替代品应用于
畜牧业生产。

*通信作者：张日俊(1962-)，男，内蒙古乌兰察布人，博士，教授，博士生导师，研究方向：饲料生物技术，E-mail:******************
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