冬虫夏草的培养及菌种鉴定

冬虫夏草的培养及菌种鉴定
作者：帖卫芳贾俊忠张叶刘瑞娟
来源：《河南农业·科技版》2018年第02期
摘要：冬虫夏草是我国的传统中药材，分布广泛，种类繁多。

本文对采自新疆的野生虫体进行分离培养，并进行菌种的纯化、染色分析及鉴定，结果表明分离到的真菌是冬虫夏草（Cordyceps scarabaeicola）。

并经过染色分析确定其形态学特点，为下一步虫草试验分析与基因修饰奠定良好的基础。

关键词：冬虫夏草；分离培养；18SrDNA；菌丝
冬虫夏草（Cordyceps sinensis）属于子囊菌纲（Ascomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）真菌。

野生虫草生长于海拔较高的寒冷区域，主要分布于我国云贵高原。

冬虫夏草性甘味温，药用价值极高，在保肺益肾、止咳化痰、止血、抗癌等方面效果良好[1-2]。

一、试验材料
（一）真菌材料
试验材料是冬虫夏草的虫体部分，试验中所用的虫草菌丝分离自该虫体部分。

DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司的Fungal DNA Mini Kit，引物的合成与测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

（二）培养基
改良CYM培养基[3-4]，1 L培养基含麦芽糖10 g、葡萄糖15 g、酵母粉2 g、蛋白胨2
g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4.6 g和维生素B1 0.3 g，pH值自然，固体培养基含0.8%～
1.0%琼脂。

二、试验方法
（一）虫草真菌的分离及纯化
1.虫草菌丝的分离
首先将虫体清洗干净，在超净工作台内吹干水分，选取中间部分用解剖刀切成1.0～1.5 cm的小段。

然后进行表面消毒，用75%酒精没过虫段浸泡3～
5 min，0.1%升汞浸泡15 min，间隔2～3 min摇晃几次，去掉两端各约0.1 cm的部分，用消毒解剖刀纵切后接种于真菌培养平板上培养，待真菌长出后用无菌的接种针挑取顶端少量菌丝转接于真菌培养基上进行继代培养。

2.虫草真菌的纯化
将分离到的菌丝转接于加有抑菌素的真菌培养基中连续培养七八次以达到纯化的目的。

将纯化好的真菌接于斜面培养基上保存于4 ℃冰箱及28 ℃培养箱中备用。

（二）虫草真菌菌丝染色
用棉兰染色剂对菌丝进行染色[5-6]。

制成临时装片，10 min后在Olympus显微镜下观察其形态特点。

（三）虫草真菌基因组DNA的提取
称取菌丝2 g，液氮研磨。

按照提取试剂盒的操作说明提取DNA。

（四）虫草真菌18S rDNA的扩增
根据真核生物18SrDNA保守序列設计引物18SrDNA（up）和18SrDNA（down）[7]。

用DNAMAN生物学软件设计引物，18SrDNA（up）：5’-agcgaaactgcgaatggc -3’；
18SrDNA（up）：5’-catccttggcaaatgctttc -3’。

然后，在25 μL的PCR反应体系中加入：DNA模板2 μL，2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，相应的引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 8.5 L。

之后进行PCR反应。

PCR反应条件为：
94 ℃预变性6 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保温1 min。

最后，将PCR凝胶切下送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

三、试验结果
（一）虫草菌丝的试验培养
分离到的菌丝接种于改良CYM培养基，20 ℃下培养，继代后一般第3天开始有生长迹象，菌丝细长（见图1）。

（二）虫草菌丝的染色分析
通过棉兰染色对虫草菌丝进行形态学观察，结果如图2所示。

从图2可知，虫草菌丝较其他真菌而言菌丝略粗，故而肉眼观察时菌丝细长浓密。

图2中A、B在不同的折光效果下拍照，两种效果结合可知，菌丝有分枝、有横隔。

（三）虫草菌丝基因组18S rDNA的扩增
经1%琼脂糖凝胶电泳，真菌DNA的18S rDNA PCR扩增结果见图3，共做2个平行对照，序列大小约为900 bp。

（四）虫草真菌测序结果分析
按照真菌保守序列18S rDNA设计的引物进行测序，结果扩增到长度为876 bp的基因序列，如图4所示。

将所得的真菌序列在NCBI上进行BLAST比对确定其为冬虫夏草（Cordyceps scarabaeicola），同源性为99%。

四、结论
本文对野生虫体进行了真菌的分离与培养，将纯化好的菌丝进行真菌基因组DNA的提取，并对真菌保守序列进行PCR，结果显示得到的序列为876 bp的碱基。

将该结果放在NCBI 上进行BLAST比对，确定其为冬虫夏草（Cordyceps scarabaeicola），同源性为99%。

通过该试验的研究可以为虫草的实验室培养及基因修饰打下基础。

（基金项目：河套学院科学技术研究项目自然科学青年项目，项目编号：HTXYZQ13010）
参考文献：
[1]丘雪红，曹莉，韩日畴.冬虫夏草的研究进展、现存问题与研究展望[J].环境昆虫学报，2016（1）：1-23.
[2]Hodge KT，Krasnoff SB，Humber RA. Tolypocladium inflatum is the anamorph of Cordyceps sub-sessils[J]. Mycologia，1996（88）：715-719.
[3]帖卫芳，贾俊忠.冬虫夏草培养条件的优化[J].河套学院学报，2015（4）：76-77.
[4]赵润，郭成金.冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化[J].天津师范大学学报（自然科学版），2008（1）：8-11.
[5]黄霞云，刘晶杰.真菌染色新方法的探索[J].实用医技杂志，2006（13）：1862-1863.
[6]陈倪勇，肖永波.介绍一种真菌的染色方法[J].中华病理学杂志，2001（5）：383-384.
[7]Noriko Kinjo，Mu Zang. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China[J]. Mycoscience，2001（42）：567-574.。