灭菌与空气除菌

缺点：
对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批
灭菌好，防止灭菌不彻底。 不适合含有大量固体物料培养基灭菌。
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分批灭菌优点：不需其他设备，操作简单易行； 不需设备进行加热冷却； 适合小型发酵罐中培养基灭菌； 适合含固体颗粒或较多泡沫培养基灭菌。 缺点：对培养基营养成分破坏较大； 培养基反复冷却耗能增加发酵周期延长； 降低发酵罐利用率。
冷空气排除情况
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（二）分批灭菌（实罐灭菌）
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌
并用空气吹干
夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀， 达70℃左右 空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽
取样管 放料管
通蒸汽 120℃，1×105pa
保温
保温阶段，凡液面以下各管道 都应通蒸汽，液面上其余各管 道则应排蒸汽，不留死角，维 持压力、温度恒定
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4. 影响培养基灭菌的因素
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物 等增加微生物的耐热性
低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随 着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以 上，则减弱微生物的耐热性。
微生物细胞含水量。含水量越少，灭菌时间越长。
培养基在灭菌之前存在各种微生物，他们的k不相同， 上式可写成
lg k
E
lg A
同一微生物在不2同.灭3菌03 温R 度下T，k不同，灭菌温度越低，k
越小；灭菌温度越高，k越大。
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(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物
芽孢。
kR NR
ks
菌数。
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连续灭菌时间的估算
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌 温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已 知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维 持时间。
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
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第三节 空气除菌
（一）发酵使用净化标准 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
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（一）发酵使用净化标准
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立 方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个 周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。
=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，
故实际保温阶段时间比计算值要短。
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（三）连续灭菌（连消）
工艺流程
喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算
㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含
孢子。
防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长 和繁殖 。
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发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
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化学灭菌：一些化学物质与微生物细胞中某种成分产
生化学反应。
Ns
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns →Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
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2. 灭菌时间的估算
例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌， 原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌 速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]
ln Nt kt N0
当Nt=0时， t=t∞，2.既30无3意/ k义lo，g 也NN不0t 可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
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菌体死亡属于一级动力学
灭菌反应速度常数k是判断微生物受热死亡难易程度的基 本依据。
温度对k影响，遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- △E/RT)
一般无法杀死所有微生物，只能杀死病原菌，所 以起消毒剂作用。
消毒剂：迅速杀灭病原菌微生物的药物。 防腐剂：抑制或阻止微生物生长繁殖的药物。 常用化学药剂：石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒
精等。
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主要用于：生产车间的环境、无菌室空间、接种操 作前小型器具及双手的消毒灯。
使用方法：浸泡、擦拭、喷洒、气态熏等。
主要用于：接种室、超净工作台、无菌培养室、物质 表面灭菌。30min
作用力：杆菌>球菌>酵母霉菌
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作用机理：微生物在紫外线照射下细胞中DNA遭到破坏， 形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复 制；空气在紫外线照射下产生臭氧也能杀菌。
干热灭菌：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度 有关的氧化还原反应迅速增加，使微生物致死率迅速增高。 160℃,1h。
连续灭菌的优点：（适用于大型罐）
可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提 高发酵产率；
发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下
分开灭菌，减少营养成分的破坏。
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第22页，共56页。Biblioteka 4. 影响培养基灭菌的其它因素
pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微 生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养 基pH愈低，灭菌所需时间愈短。
培养基的物理状态 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加
入少量消泡剂 。
培养基中的微生物数量 搅拌
主要用于：玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品灭 菌。
作用机理：干燥高温条件下，微生物细胞内各种与温度有 关的氧化还原反应迅速增加，使微生物致死率提高。
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第二节 培养基与设备灭菌 ** （一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
k↓，热阻↑, t↑
ln Nt kt N0
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1. 热阻
当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时， 可取细菌芽孢的k值为标准。
当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- △E/RT) ∴ k与微生物活化能及T有关 k越小，微生物越耐热
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（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
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1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻（微生物细胞在某 一特定条件下死亡致死时间），可用比死亡速率常数k 来表示 。
dN kN dt
灭菌主要机理：一些化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）
与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，使蛋白质 变性、核酸破坏、酶类失活、细胞膜透性改变而杀死 微生物。
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射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产 生的γ射线进行灭菌的方法。
波长范围：200~275nm紫外线，杀菌最强范围 250~275nm,253.7nm最强。
t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
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喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
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分批灭菌与连续灭菌的比较
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湿热灭菌：高温使微生物体内的一些重要蛋白质发生凝固、
变性，从而导致微生物无法生存而死忙。
用于：培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材 等。
机理：蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿 透力，在高温蒸汽的作用下，使微生物细胞中蛋白 质、酶核酸分子内部的化学键和氢键受到破坏，致 使微生物再短时间内死亡。
k' A'exp( E') RT
k Aexp( E ) RT
都与相应的活化能及T有关
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3. 灭菌温度和时间的选择
当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培 养基成分分解速率增加倍数，故一般选 择高温快速灭菌 。
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2. 空气除菌流程的分析
空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、过滤
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空气洁净度：洁净环境中空气含尘量多少的程度。
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（二） 空气除菌流程
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1. 对空气过滤除菌流程的要求
流程主要设备：空气压缩机 、空气过滤器
附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器
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1. 对空气过滤除菌流程的要求
保温结束，依次关闭各排 汽、进汽阀门
罐压接近空气压力
向罐内通无菌空气
夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度
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2. 灭菌时间的估算
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌 的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式
㏑(N/N0) =-kt
来粗略估算灭菌所需时间。 分批灭菌过程：升温、保温冷却3个阶段。
流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑 环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件； 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施 ；
压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染 ，也可
采用无油润滑的往复式压缩机；
往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。
通常要求压缩空气的相对湿度Φ=50%~60%时通过过滤器为好。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时 间t不同。
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3. 灭菌温度和时间的选择
培养物质受热破坏也可看作一级反应：
dC k'C dt 式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
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干湿热比较：湿热优于干热。
一方面是细胞内蛋白质含水量较高；另一方面高温水蒸气对 蛋白质有较高的穿透力，从而加速蛋白质变性而使微生物死 亡。
一般121℃维持20-30min。
致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：杀死全部微生物所需的时间。
例：微生物营养细胞在60℃加热10min。芽孢100℃加热 10min---1h。
灭菌与空气除菌
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第一节 常用灭菌方法
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生 命物质的过程。
消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器 和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其
大肠杆菌在不同温度下
的残留曲线
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下 的死亡曲线
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2. 微生物热死定律：
(1) 对数残留定律
在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热
死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比称为残留定律，
即
dN kN dt