青蒿素对乳腺癌MT40的抑制作用及对CD71表达的影响

青蒿素对乳腺癌MT40的抑制作用及对CD71表达的影响余和平;崔乐;王必蓉;潘跃进
【摘要】目的探讨青蒿素对乳腺癌细胞MT40的抑制作用及对CD71表达的影响.方法采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度青蒿素对乳腺癌MT40细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测其对CD71表达的影响.建立MT40荷瘤小鼠模型,分为阴性对照组、青蒿素实验组、阳性对照组,测量各组肿瘤体积并制作生长曲线,检测各组肿瘤组织的细胞凋亡率及CD71的表达.结果不同浓度的青蒿素作用后,均对MT40细胞增殖产生了抑制作用,50、100、150、200 μmol/L青蒿素实验组细胞增殖抑制率分别为(16.32±0.12)％、(28.13±0.28)％、(44.36±0.23)％、(54.32±0.41)％,呈剂量依赖性;青蒿素作用后MT40细胞CD71表达受到抑制,50、100、150、200 μmol/L青蒿素实验组细胞CD71阳性表达率分别为(54.43±2.15)％、(46.32±2.14)％、(37.22±1.98)％、(30.75±2.87)％,100 μm ol/L及以上浓度青蒿素可以明显抑制细胞CD71的表达(P＜0.05).与阴性对照组比较,青蒿素实验组、阳性对照组荷瘤鼠肿瘤生长均受到抑制(均P＜0.05);细胞凋亡率,青蒿素实验组为(21.23±4.56)％,阳性对照组为(17.42±1.23)％,阴性对照组为(1.22±0.33)％,青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=8.193,P＜0.05),而与阳性对照组相比差异无统计学意义(t=1.140,P＞0.05);CD71表达阳性率,阴性对照组为(77.81±4.33)％,阳性对照组为(70.42±5.23)％,青蒿素实验组为(40.23±4.56)％,青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=7.371,P＜0.05),与阳性对照组相比差异亦有统计学意义(t=5.338,P＜0.05).结论青蒿素对乳腺癌细胞MT40具有显著抑制生长、诱导细胞凋亡作用,其机制可能与下调肿瘤组织CD71的表达有关.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2016(045)006
【总页数】5页(P618-622)
【关键词】青蒿素;乳腺癌;CD71;细胞凋亡
【作者】余和平;崔乐;王必蓉;潘跃进
【作者单位】武汉市普爱医院甲状腺乳腺外科,武汉430033;武汉市普爱医院甲状
腺乳腺外科,武汉430033;武汉市普爱医院甲状腺乳腺外科,武汉430033;武汉市普
爱医院甲状腺乳腺外科,武汉430033
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，在乳腺癌综合治疗中，药物治疗占重要地位，临床广泛使用的化疗药物易产生显著的毒副作用及耐药性。

青蒿素是由我国研制的抗疟药，具备抗疟效果突出、体内过程稳定、半哀期较短、消除较快、毒副作用小、价格低廉的特点，近年发现其具有抗多种肿瘤的作用及耐药逆转作用。

本研究探讨青蒿素在体内外对小鼠乳腺癌MT40细胞的作用及与CD71表达的关系，以期为
乳腺癌的治疗寻找新途径。

1.1 实验材料及仪器
昆明小鼠，4～6周龄，体质量(22±2)g，雌性，由江西省中医学院实验动物中心
提供。

主要实验材料：青蒿素(陕西汇生医药科技有限公司)，丝裂霉素(MMC，浙江海正药业股份有限公司)，高糖DMEM培养液(HYCLONE公司)，胎牛血清(FCS 杭州四季青公司)，噻唑蓝(MTT，Amresco公司)，小鼠CD71一抗(BD公司)，乳腺癌MT40细胞株(本实验室液氮保存)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯
基生物科技发展有限公司)，CD71 ELISA试剂盒(BD公司)。

主要仪器：倒置显微镜(重庆重光仪器公司)，LD4-2台式离心机(北京医用离心厂)，电热恒温水浴箱(北京长风仪器厂)，BB 16HF二氧化碳气体培养箱(香港力新仪器公司)，超净工作台(北京长城空气净化工程公司)，Multiskan Ascent全自动酶标仪(芬兰Thermo Labsysterms公司)，UFRO-01纯水装置(军事医学科学院卫生装备研究所)，流式细胞仪(FACS Calibur SE，美国BD公司)。

1.2 体外实验
1.2.1 实验分组实验分3组：①阴性对照组，不加任何药物；②青蒿素组，分别加入不同浓度的青蒿素溶液，使其终浓度分别为50、100、150、200 μmol/L；③阳性对照组，加10 μmol/L丝裂霉素。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测乳腺癌MT40细胞生长 MT40细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液加双抗、37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。

2 d换培养液1次，胰蛋白酶消化、传代和收集细胞。

将处于对数生长期的MT40细胞以
5×104/mL密度加入96孔培养板，置于5%CO2的培养箱中培养12 h，按分组分别给予相应药物。

继续培养16 h后，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，温浴4 h，弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，作用10 min并微振荡后，在酶标仪上检测490 nm波长吸光度值(A)。

重复实验3次。

按下列公式计算细胞生长抑制率：(1-实验组A值/对照组A值)×100%[1]。

1.2.3 流式细胞术检测MT40细胞中CD71的表达将生长状态良好的MT40细胞接种于12孔培养板中，每孔细胞密度5×105/mL，加培养液至体积2 mL，培养12 h。

按分组分别给予相应药物。

继续培养16 h后消化，分别收集于离心管中(细胞密度达5×106/mL)，制备单细胞悬液，洗涤，固定，4℃过夜，CD71-PE染色、避光孵育30 min，上机检测。

1.3 动物实验
1.3.1 动物模型建立传代培养MT40细胞，收集对数生长期细胞，以无菌生理盐
水调整细胞密度至5×106/mL，制成细胞悬液，将MT40乳腺癌细胞悬液注入小
鼠背部皮下，每只0.5 mL，待肿块长至直径0.8 cm左右时开始进行实验。

本组
动物实验模型肿瘤接种成功率为63.3%(19/30)。

1.3.2 实验分组荷瘤鼠称重后随机分3组，每组6只。

青蒿素实验组：青蒿素悬
液150 mg/kg灌胃，每日2次，连续给药10 d；阴性对照组：喂服相同量生理
盐水；阳性对照组：丝裂霉素3.0 mg/kg灌胃，每日2次，连续给药10 d。

末次给药24 h后颈椎脱臼处死动物。

1.3.3 观察指标①肿瘤生长：每天测量瘤体最大径(A)、最小径(B)，计算肿瘤体积(V=1/2×A×B2)，制作肿瘤生长曲线；处死实验动物后剪开肿瘤部位，剥离瘤块，用滤纸吸净其上液体，测量瘤体质量。

②肿瘤组织细胞凋亡率：肿瘤组织经过固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、切片后，用TUNEL法检测细胞凋亡，操作步骤按试剂盒说明书进行，阳性为细胞核呈棕褐色的细胞，每张切片随机取5个高倍
视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。

③CD71检测：操作步
骤按试剂盒说明书进行，用PBS替代第一抗体作为阴性对照。

光镜下细胞膜呈黄
色至棕色染色为阳性，细胞膜无色而细胞核蓝染为阴性。

每张切片随机取5个高
倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。

1.4 统计学方法
实验数据采用SSPS 13.0统计软件处理。

实验结果以均数±标准差表示，计数资料比较采用方差分析，P<0.05时，选用LSD进行组间两两比较，计量资料进行组间t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 青蒿素对MT40细胞增殖的抑制作用
不同浓度的青蒿素作用后均对MT40细胞增殖产生了抑制作用(F=4 256.57，
P<0.01)，在50～200 μmol/L浓度范围内，抑制作用随着青蒿素浓度的升高明显
增强，见表1。

F=4 256.57，P<0.01；与阳性对照组比较，*P<0.05
2.2 青蒿素对MT40细胞CD71表达的抑制作用
流式细胞仪检测各组MT40细胞CD71表达见图1。

各组CD71表达差异有统计
学意义(F=17.56，P<0.01)。

阴性对照组与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；阴性对照组、阳性对照组与50 μmol/L青蒿素组相比差异均无统计学
意义(P>0.05)，而与其他各青蒿素组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；青蒿素
各实验组两两比较，除了50 μmol/L与100 μmol/L组、150 μmol/L与200
μmol/L青蒿素组间比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

表明100 μmol/L及以上浓度青蒿素可以明显抑制细胞膜
CD71的表达。

见表2。

F=17.56，P<0.01；与阳性对照组比较，*P<0.05
2.3 青蒿素对移植瘤生长的抑制作用
在实验过程中，丝裂霉素阳性对照组荷瘤小鼠饮食量明显减少，且出现毛色粗糙灰暗等现象，而其他各组正常；各组荷瘤小鼠皮下移植肿瘤体积随时间延长继续增大，阴性对照组肿瘤体积增大明显，与阴性对照组相比，青蒿素实验组、阳性对照组荷瘤鼠肿瘤体积增长均受到抑制。

各组最终瘤体体积为：阴性对照组
(3.42±0.35)c m3，青蒿素实验组(2.09±0.31)cm3，阳性对照组(2.02±0.22)cm3，青蒿素实验组与阴性对照组比较差异有统计学意义(t=3.437，P<0.05)，青蒿素实验组与阳性对照组比较差异也有统计学意义，(t=3.493，P<0.05)。

各实验组瘤体倍增时间为：阴性对照组2.77 d，青蒿素实验组3.45 d，阳性对照组3.44 d。

肿瘤生长曲线见图2。

2.4 青蒿素对肿瘤组织细胞凋亡的诱导作用
凋亡细胞表现为细胞核固缩，细胞核变圆，TUNEL染色为细胞核染为棕黄色(见图
3)。

阴性对照组可见零星细胞凋亡，凋亡率为(1.22±0.33)%，青蒿素实验组、阳性对照组可见较多细胞凋亡，青蒿素实验组细胞凋亡率为(21.23±4.56)%，阳性对照组为(17.42±1.23)%，3组间比较差异有统计学意义(F=14.72，P<0.05)；青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=8.193，P<0.05)，而与阳性对照组相比差异无统计学意义(t=1.140，P>0.05)。

2.5 青蒿素对肿瘤组织CD71表达的抑制作用
CD71的表达主要分布在细胞膜，胞质内也有一定的表达(图4)。

CD71表达阳性率，阴性对照组为(77.81±4.33)%，阳性对照组为(70.42±5.23)%，青蒿素实验组为(40.23±4.56)%，3组间比较差异有统计学意义(F=15.64，P<0.05)。

青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=7.371，P<0.05)，与阳性对照组相比差异也有统计学意义(t=5.338，P<0.05)。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在我国占女性恶性肿瘤的7%～10%，其发病率还在逐年上升，严重威胁广大妇女的身心健康[1]。

随着对乳腺癌生物学行为的深入研究，目前普遍认为乳腺癌是一种全身性疾病。

手术治疗是乳腺癌治疗的重要方法，手术结果对判断预后有重要意义，手术治疗的发展趋势为手术范围逐渐缩小，术后综合辅助治疗加强[2]。

在乳腺癌综合治疗中，药物治疗占重要地位，临床广泛使用的化疗药物易产生显著的毒副作用及耐药性，寻找对乳腺癌高效，低副作用的治疗方法具有重要意义。

青蒿素是我国科研工作者研制出的抗疟药，近年研究发现青蒿素对多种肿瘤细胞具有明显杀伤作用，对耐药性乳腺癌有耐药逆转作用[3-4]。

其抗肿瘤的作用机制为药物与肿瘤细胞内铁离子结合，引起分子内过氧桥裂解产生活性自由基攻击红细胞内膜系统，发挥氧化、细胞周期延迟、抗肿瘤血管生成、致癌基因改变和肿瘤抑制基因表达以及多重耐药抗性作用，通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白诱导细胞凋亡[5]。

CD71为识别95 kD转铁蛋白受体(TfR)，是一种介导细胞内铁摄取和调
节细胞生长相关的Ⅱ型跨膜糖蛋白，与转铁蛋白结合，主要表达于增殖细胞膜，介导细胞对铁的摄取[6]。

在CD71介导下，铁被细胞摄取，促进DNA的合成、细
胞增殖及细胞内电子呼吸链传递有序进行[7]，与无增殖活性细胞相比，增殖活跃
的非肿瘤细胞和肿瘤细胞CD71的表达明显升高[8]。

Leplletier等[9]研究表明，
非何杰金瘤细胞CD71表达远高于正常B细胞。

Dowlati等[10]研究显示，肺癌组织CD71的表达与组织分化程度密切相关，低分化者CD71呈高表达，高分化者CD71呈低表达。

Gomme等[11]认为，CD71的表达与肿瘤基因被激活有关。

大量研究表明，CD71在肿瘤细胞的表达与TNM分期、肿瘤分化程度、细胞异型程度及核分裂计数等密切相关，可反映肿瘤细胞的增殖状况，因此，降低肿瘤组织CD71的表达对肿瘤治疗有重要意义。

丝裂霉素为抗肿瘤抗生素，其机制为与肿瘤细胞DNA交联反应产生抗肿瘤作用，已应用于临床多种肿瘤的治疗，也用于复发性乳腺癌的治疗。

本研究也证实丝裂霉素对乳腺癌MT40细胞具有明显抑制作用。

本研究发现，不同浓度青蒿素对乳腺癌MT40具有抑制细胞生长作用，与阳性对
照组相比，50 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率小于阳性对照组，100 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率与阳性对照组相比，差异没有统计学意义，150 μmol/L及200 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率大于阳性对照组，表明浓度越高，青蒿素对乳腺癌MT40细胞生长抑制作用越强。

本研究还发现，青蒿素在抑制MT40细胞
增殖同时，还明显降低MT40细胞CD71表达，在50～200 μmol/L浓度范围内，随着浓度的升高，降低CD71表达作用越明显，而丝裂霉素在抑制MT40细胞增
殖作用同时，不具有降低MT40细胞CD71表达的作用，表明青蒿素对乳腺癌
MT40细胞具有抑制增殖的同时，还具有改善临床预后的能力。

从这个角度来看，青蒿素对乳腺癌MT40细胞作用优于丝裂霉素。

综上所述，青蒿素对乳腺癌MT40细胞在体外具有抑制细胞生长作用，呈剂量依
赖性，在体内具有延长肿瘤倍增时间、抑制生长、诱导细胞凋亡作用，并且下调肿
瘤细胞及组织CD71的表达。

青蒿素对乳腺癌MT40的抗肿瘤作用具有重要临床意义，其可能通过下调肿瘤组织CD71的表达而发挥抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡作用，然而具体机制尚有待进一步研究。

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