PCR的注意事项

①变性温度与时 间：变性温度低， 解链不完全是导 致PCR失败的最 主要原因。一般 情况下，93℃～ 94℃min足以使 模板DNA变性， 若低于93℃则需 延长时间，但温 度不能过高，因 为高温环境对酶 的活性有影响。 此步若不能使靶 基因模板或PCR 产物完全变性， 就会导致PCR失 败。
寡核苷酸（dNTP）
3.(G+C ） % 含量引物 的组
成应均匀，尽量避免 含有相同的碱基多聚 体 。 两 个 引 物 中 （ G+C ） %含量应尽量 相似。 4. 引物内部应避免内部形 成发夹结构 5.引物长度：15-30bp， 常用为20bp左右
6.引物扩增跨度：以200-500bp为 宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。 7.引物中有或能加上合适的酶切 位点， 被扩增的靶序列最好有适 宜的酶切位点， 这对酶切分析或 分子克隆很有好处
防止污染的方法
5：设立适当的阳性对 照和阴性对照，阳性对 照用于结果可预知的样 品，证明实验体系正常， 防止PCR抑制造成的假 阴性。阴性对照：不加 模板的试剂对照，检查 污染，进行反转录PCR， 用于未转录的对照来防 止基因组DNA的污染
6：配制的 时候需要 充分混匀， 比如溶解 引物，需 要先混匀 再分装。 还有DNA 提取之后 最好4度过 夜之后再 做PCR，这 有利于 DNA的充 分溶解。
引物在PCR反应中的浓度 1. 一般在0.1～1μM之间。 2. 浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。 3. 一般来说用低浓度引物经济、 特异，但浓度过低，不足以完 成30个循环的扩增反应，则会 置变性-退火-延伸三个 温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70～75℃，在Taw DNA 聚合酶的作用下，使引 物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为 100～300bp时）可采用二温度点法， 除变性温 度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taw DNA酶仍有较高的催化活性）。
②退火（复性）温度与时 间：变性后温度快速冷却 至40℃～60℃，可使引物 和模板发生结合。由于模 板DNA 比引物复杂得多， 引物和模板之间的碰撞结 合机会远远高于模板互补 链之间的碰撞。退火温度 与时间，取决于引物的长 度、碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长度。对 于20个核苷酸，G+C含量 约50%的引物，55℃为选 择最适退火温度的起点较 为理想。
PCR循环次数
*常规PCR循环次数一般为25～40 个周期。 *循环次数过多，非特 异性背景严重，复杂度增加。 * 循环反应的次数太少，则产率 偏低。 所以，在保证产物得率前提下， 应尽量减少循环次数。
PCR技术中最 令人头痛的 问题是：
易污 染
防止污染的方法
1：避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。 2：引物设计要正确，选择可靠的生物公司合成引物，如果公司 不好，给的引物会不出结果。据说上海生工不错。 3：DNA提取要成功。 4：引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量会抑制体系 的反应
模板变性温度
* 是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的 温度，达不到变性温度就不会产生单 链DNA模板，PCR也就不会启动。 * 变性温度低则变性不完全， DNA 双 链会很快复性，因而减少产量。一般 取90～95℃。 * 加入 Taw DNA聚合酶后最高变性温 度不宜超过95℃ ，以保持DNA聚合酶 的活力。
PCR缓冲液:
PCR 的标准缓冲液为 10 ～ 50mM 的 Tris –Hcl 缓 冲液 和1.5mMgCl。 Mg2+的存在至关重要，影响PCR的特异性和 产量。 Mg2+过量易生成非特异性扩增产物， Mg2+不足易使产量降低 反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时， Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度 过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
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在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑 制Taq酶的活 性 , 高浓度 dNTPs 易产生错误掺入，而浓度太低，可降低 反应物的产量。 PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。 四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低， 都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止 反应。
当使用高分子量的dna如基因组dna做模板时如果用适当的酶先进行消化再作为模板扩增效果会更模板模板模板核酸的量与纯化程度是pcr败与否的关键环节之一模板变性温度是决定pcr反应中双链dna链的温度达不到变性温度就不会产生单链dna模板pcr也就不会启变性温度低则变性不完全dna双链会很快复性因而减少产量
引物的设计：
1. 长度一般最低不少于 16 个核 苷酸，而最高不超过30个核 苷酸，最佳长度为20～24个 核苷酸。有时可在 5’ 端添加 不与模板互补的序列，如限 制性酶切位点或增强因子等， 以完成基因克隆和其它特殊 2.两个引物之间不应发生互补， 需 要 ， 但 要 在 酶 切 位 点 的 特别是在引物 3’ 端，即使 5‘ 端加上额外的 3－4个核苷 无法避免，其 3’ 端互补碱 酸，以确保附加的酶切位点 基也不应大于 2 个碱基， 有效。 否则易生成“引物二聚 体”。
PCR技术 注意事项
引物类的注意事项 温度与时间的注意事项
引物的设计 引物在PCR反应的浓度
寡核苷酸（dNTP）使用注意事项
Taq DNA聚合酶使用注意事项
模板
模板的种类 模板变性温度
注意事项
PCR缓冲液使用注意事项
PCR循环次数注意事项 防止污染的方法
一、引物 两引物间距离决定扩增片 段的长度， *两引物的5’端 决定扩增产物的两个5’末端 位置 由于引物是决定PCR扩增片 段长度、位置和结果的关 键， 因此，引物设计也就 更为重要。
Taq DNA聚合酶
由于DNA模板的不同和引物不同， 以及其它条件的差异，聚合酶的 用量亦有差异，酶量过多会导致 非特异产物的增加
模板
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成 败与否的关键环节之一
模板的种类：
单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 模板 的样品。若起始材料是 RNA ，须先通 过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作 模板时，线性化的比环状的效果好， 但在实际操作中，往往不需要将质粒 线性化，而直接用做模板。当使用高 分子量的 DNA （如基因组 DNA ）做模 板时，如果用适当的酶先进行消化再 作为模板，扩增效果会更好。