HCMV感染对HEL细胞周期及复制允许因子Cdt1影响

第三章结果
ｌ、感染后两组ＨＥＬ细胞形态学的改变
１００ＴＣＩＤ。

的ＨＣＭＶＡＤｌ６９株感染Ｇ。

／Ｇ。

期同步的ＨＥＬ细胞后，１２ｈ、２４ｈ和４８ｈ均未发现明显形态学改变（图１），７２ｈ起可见局部成簇细胞变圆，膨胀，胞体及胞核巨大化（图２）。

７天时可见视野下所有细胞均发生病变（图３）。

模拟感染组ＨＥＬ细胞在各时间点均未见形态学改变（图４）。

图１图２
图３图４
图１～４ＨＣＭＶ感染后ＨＥＬ细胞形态的变化（１０１０）
２、免疫细胞化学法检测ＨＥＬ细胞核内ＨＣｗＩＥ。

７２蛋白
感染组各时间点的ＨＥＬ细胞均在核内出现棕黄色颗粒的ＨＣＭＶＩＥ，７２蛋白（图５～９）。

感染组感染后１２ｈ时细胞核内已出现棕黄色颗粒，量较少，染色不深（图
５）。

２４ｈ时棕黄色颗粒较１２ｈ增多，染色比１２ｈ时无明显加深（图６）。

４８ｈ时阳性产物染色较前明显加深（图７）。

７２ｈ时阳性产物较多堆积在局部区域细胞核内，染色较深（图８）。

９６ｈ时局部病变现象较７２ｈ时更为明显（图９）。

模拟感染组ＨＥＬ细胞在各时间点均未出现棕黄色颗粒（图１０）。

图５图７图６
图８
图９图１０
图５～１０免疫细胞化学检测ＨＥＬ细胞核内ｔｌＣＭＶＩＥ·７２蛋白（２０ｘ１０）
２
３、用流式细胞术测定ＨＥＬ细胞周期
３．１血清饥饿后的ＨＥＬ细胞周期
流式细胞术检测血清饥饿后的ＨＥＬ细胞结果为：８２．８％的细胞处于Ｇ。

／Ｇ．期（图１１），证实ＪｆＩＬ清饥饿法将绝大部分细胞同步在Ｇ。

／Ｇ．期。

图１１血清饥饿后的ＨＥＬ细胞周期分布
３．２两组ＨＥＬ细胞感染后１２ｈ、２４ｈ的细胞周期
模拟感染组ＨＥＬ细胞在感染后１２ｈ时有６５．７％的细胞处于Ｇ。

期，２６．４０／６０细胞处于ｓ期（图１２）：２４ｈ时有４３．８％的细胞处于Ｇ，期，２４．６％细胞处于ｓ期（图１３）。

感染组ＨＥＬ细胞在感染后１２ｈ时有７０．４％的细胞处于Ｇ，期，２２．４％细胞处于ｓ期（图１４）；２４ｈ时有６９．９％的细胞处于Ｇ，期，１２．４％细胞处于ｓ期（图１５）。

图１２模拟感染组感染后１２ｈ时细胞周期分布
图１３模拟感染组感染后２４ｈ时细胞周期分布
图１４感染组感染后１２ｈ时细胞周期分布
４
颂＋学位论文第三章结果
图１５感染组感染后２４ｈ时细胞周期分布
３．３两组感染后１２ｈ、２４ｈ处于Ｇ。

期的细胞数比较
感染后１２ｈ和２４ｈ时两组处于Ｇ，期的细胞数均有显著性差异（见表１和表２）感染组较模拟感染组明显增多。

表ｌ１２ｈ时感染组和模拟感染组处于Ｇ－期的细胞数
Ｘ２２５０８０．０３５Ｐ＝０．０００
表２２４ｈ时感染组和模拟感染组处于Ｇｔ期的细胞数
Ｘ２２１３８８４８．０３９Ｐ＝ｏ．０００
４、ＣｄｔｌｍＰ，Ｎ＾在感染后两组ＨＥＬ细胞中的表达水平
４．１ＲＮ＾抽提结果
紫外分光光度计测总ＲＮＡ的０Ｄ值，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值为１．８～２．０，表明所
硕十学位论文第三章缔果
提总ＲＮＡ浓度和纯度较高，从１．５％的琼脂糖凝胶电泳图观察总ＲＮＡ的质量（图１６），可作为逆转录的模板。

图１６总ＲＮＡ电泳图
４．２Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＳ＾扩增产物
将逆转录后的ｃＯＮｈ模板进行Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ扩增，扩增产物进行１．５％的琼脂糖凝胶电泳（图１７），各个模板在近５００ｂｐ处均可见目的条带出现，证实逆转录过程成功，ｃＤＮＡ模板有效。

图１７Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ扩增产物电泳图
注：Ｍ：ｍａｒｋｅｒ。

泳道１、３、５、７、９分别表示模拟感染组感染后１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ时Ｄ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ表达水平；泳道２、４、６、８、１０分别表示感染组感染后１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ时Ｄ—ａｃｔｉｆｌｍＲＮＡ表达水平。

４．３ＣｄｔｌｍＰ，ＮＡ与Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ同管扩增产物
以逆转录后的ｃｎＮｈ为模板，将ＣｄｔｌｍＲＮＡ与Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ同管扩增，扩
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增产物进行１．５％的琼脂糖凝胶电泳（图１８），于近５００ｂｐ和３００ｂｐ处分别可见一目的条带出现。

图ｌ８ＣｄｔｌｍＲＮＡ与Ｄ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ同管扩增产物电泳图
注：Ｍ：ｍａｒｋｅｒ。

泳道１．３、５、７、９分别表示模拟感染组感染后１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ时Ｄ—ａｃｔｉｎｍＲＮＡ及ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平；泳道２、４．６、８、１０分别表示感染组感染后１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ时Ｂ—ａｃｔｉｎｍＲＮ＾及ＣｄｔＩｍＲＮＡ表达水平。

４．４两组ＨＥＬ细胞各时间点ＣｄｔｌｍＰ，Ｎ＾表达水平比较
１２ｈ、２４ｈ和４８ｈ两组ＩｔＥＬ细胞ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平均有显著性差异，１２ｈ和２４ｈ时感染组较模拟感染组明显降低，４８ｈ时感染组较模拟感染组明显升高（见表３）。

将其制成时间与ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平点线图显示，模拟感染组在感染后１２ｈ时ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平最高，后逐渐下降，至７２ｈ时达最低水平，９６ｈ时又稍有回升，但未达到１２ｈ时表达水平，仪与４８ｈ时表达水平相当；感染组在感染后１２ｈ时ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平较低，２４ｈ时稍有升高，４８ｈ达最高峰，４８ｈ后～７２ｈ急剧下降，９６ｈ时大致维持７２ｈ水平（见图１９）。

表３感染组和模拟感染组各时间点ＣｄｔｌｍＲＮＡ的表达水平
图１９两组ＣｄｔｌｍＲＮＡ表达水平随时间的变化情况。