蛋白质工程手段修饰干扰素的实际应用研究进展

蛋白质工程手段修饰干扰素的实际应用研究进展
程天翼;高向东;靳维维;顾觉奋
【摘要】干扰素是一类具有抗病毒、抗增殖、免疫调节等生物学功能的细胞因子,也是临床上抗病毒抗肿瘤的常用药.但是,干扰素不稳定、半衰期短等缺点限制了它的应用.近年来,一系列蛋白质工程手段被用于修饰干扰素并取得了良好的结果.针对延长半衰期,聚乙二醇修饰、糖蛋白修饰、白蛋白修饰、人 lgG免疫球蛋白Fc片段融合被证明有效,而去唾液酸糖蛋白受体介导的靶向修饰、人源化抗HBs抗体基因融合及肿瘤靶向病毒载体的构建也为干扰素靶向修饰提供了新的选择.现对蛋白质工程手段在修饰干扰素方面的实际应用做一概述.
【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》
【年(卷),期】2011(032)004
【总页数】5页(P156-160)
【关键词】干扰素;定点突变;基因融合;半衰期;靶向药物
【作者】程天翼;高向东;靳维维;顾觉奋
【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009
【正文语种】中文
【中图分类】R978.7
干扰素（interferon，IFN）属于糖蛋白，是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。

根据人类干扰素产生的来源和结构不同可分为α干扰素、β干扰素和γ干扰素3类。

其中抗病毒活力最高的IFN-α又分为I型和II型，至少有23个不同变种，这些蛋白的分子量为19～26 kDa，由156～166 或 172 个氨基酸组成。

IFN-α为第一个广泛应用于临床并取得明显疗效的细胞因子，已被FDA批准应用于病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等疾病。

但干扰素相对分子量较小，易被肾小球滤过，易被血清蛋白酶降解，半衰期短需一周3次频繁给药，副作用较大等缺点导致患者依从性低。

因此，改善IFN-α代谢动力学及药效学特征的研究正在广泛进行。

随着基因工程的发展，改善IFN-α特征的主要技术手段有聚乙二醇修饰，糖基化修饰，白蛋白修饰，lgG Fc片段修饰，靶向修饰等。

本文对其最新研究进展作一概述。

聚乙二醇（PEG）修饰又称PEG化（PEGylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。

将PEG与IFN分子偶联，修饰后产物分子量增加使肾小球滤过率下降；位阻效应使其抵抗蛋白酶水解能力提高、抗原决定簇被遮挡、免疫原性下降；半衰期延长、血浆清除率降低等。

但PEG阻碍了IFN与受体结合，活性常会大幅下降。

目前PEG修饰技术已较成熟，随着分子构建技术的发展，非定点修饰逐渐转变为定点修饰。

美国先灵葆雅公司早在2000年推出世界上第一个长效干扰素:12KD PEG-IFN-
α2b佩乐能(Peg-Intron)，获得了欧洲及美国药监局批准。

它是由E.Coli生产，使用甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（NHS-mPEG）修饰IFN的His残基和Lys残基，NHS-mPEG和His成键不稳定，在体内会断裂释放IFN-α2b起到缓释作用。

2002年，瑞士罗氏公司使用40KD的分支化（含两条PEG链）NHS-mPEG与IFN-α2a的11个Lys残基分别反应，得到了含稳定酰胺键的PEGIFN-
α2a派罗欣（Pegasys）并获得了FDA批准。

静脉注射后，佩乐能半衰期是40h，为未修饰IFN的10倍，活性保留为原来的28%。

派罗欣半衰期是80h，保留1%活性 [1]。

选择大小、形状合适的修饰剂是PEG修饰技术的关键。

续双分支化PEG被罗氏使用后，Jo等[2]使用一种43kDa三联体PEG修饰IFN-α2a，单修饰PEG3-IFN-
α2a体外活性为10%，优于派罗欣，小鼠体内半衰期为未修饰IFN的40倍。

鉴于IFN中PEG非定点修饰位点咪唑基、氨基数量多,有时甚至达数10个，最终
产品常含异构体和多修饰体，给纯化和质控步骤带来很多麻烦。

通过定点突变引入游离半胱氨酸，再进行PEG定点修饰，可提高生产的可控性。

2008年，Bell等[3]将IFN-α2的111位Met突变为Cys得到IFN-M111C，以20kDa和40kDa的PEG修饰后，分别保留了原蛋白活性的1/2和1/3，延长半衰期26倍和38倍；
与佩乐能体外活性区别不大，却是40kDa的PEG非定点修饰的派罗欣体外活性的7～10倍。

同时 20kDa PEGIFN-M111C在裸鼠抗肿瘤实验中有明显疗效。

这一
进展打破了以往共识，证明了IFN-α2在某些不重要位点突变并经PEG修饰，生
物活性仍可以在很大程度上得以保留。

北京三元基因牛晓霞等[4]使用高生物活性重组集成干扰素IFN-Con和黄种人特有低副作用IFN-α1b的分子序列作为模板，利用DNA Shuffling技术进行分子重组和筛选，获得了高效低毒的IFN-Con-m1，然后将其86位Tyr突变为Cys，得到可供定点修饰的IFN-Con-m2，再用20kDa的PEG-MAL进行修饰，得纯度高于98%的PEG-IFN-Con-m2，保留了未被修饰时体外活性的1%，半衰期18h，稳
定性经抗胰蛋白酶水解实验验证增强显著。

蛋白质表面糖链能够影响蛋白的药物动力学性质、生物活性和稳定性等，糖基化同时也为某些蛋白质发挥生物活性所必需。

添加的糖链一方面增大了IFN的分子量
及空间体积，减少了肾小球的滤过效应；一方面由于富含唾液酸提高了电荷相应减
少了肾消除作用；另外由于与受体亲和力减小，在很大程度上也避免了受体介导的清除作用。

糖基化干扰素目前仍处于临床前动物实验阶段，但已有多份研究报告展示了其良好前景。

2008年，Dissing-Olesen等[5]以小鼠经IFN诱导产生的抗病毒蛋白MX蛋白的mRNA量作为观测指标对IFN-β1a N端糖基化相关理论做了系统的研究，证明糖基化的糖链结构尤其是糖链末端的唾液酸残基对于稳定和增溶IFN有着明显的作用。

Ceaglio等[6-7]近几年针对IFN-α的N端糖基化进行了深入研究。

通过点突变，向重组hIFN-α2b序列中插入4个N端糖基化保守序列，构造潜在N端糖基化位点Asn-X-Ser/Thr（X可以是除脯氨酸以外任意氨基酸）。

IFN通过中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达，N端可自行完成糖基化修饰，得到4N糖基化干扰素（4N-IFN）。

远紫外圆二色谱（CD）证明，IFN结构未因糖基化影响而发生改变。

4N-IFN保留了未修饰IFN体外活性的10%，半衰期延长了25倍，较佩乐能半衰期
更长；小鼠静脉注射后线下面积增长10倍，体内分布也更广泛，并有显著的体内抗肿瘤活性。

4N-IFN对血清蛋白酶、酸性pH、热、反复冻融的稳定性较未修饰IFN均有所提高，溶解度和熔点更有明显提高。

MALDI-TOF MS 和 HPAEC-PAD 的糖检测结果显示，4N-IFN有大量的四联和三联N-糖链结构，这种结构使其具
有了优良特性。

利用基因融合技术可以将IFN与特定蛋白共表达，新分子兼有两者特点。

目前常
用的IFN修饰蛋白有人血清白蛋白和抗体Fc片段，均用于改善药物半衰期。

人血清白蛋白（HSA）是人血清中含量最高的物质输送载体，分子量约为65KDa，是585个氨基酸组成的单链球型蛋白质。

HSA无酶学及免疫学活性，体内半衰期长达19d [8]。

目前，由人类基因科技公司和诺华公司合作开发的人血清白蛋白融合干扰素——
ZALBIN（albinterferon alfa-2b，又名Albuferon®）已上市，主要用于治疗丙
型肝炎，分子结构模型如图1所示。

它由酵母表达系统表达，为HSA的 C端与IFN-α2b的N端直接融合形成的单链蛋白质分子，分子量为85.7KDa。

临床试验表明，其平均清除半衰期为159h，有效性和安全性与佩乐能相当。

我国科学家Huang等[9]通过连接肽将HSA的C端与IFN-α2b的N端连接，由
毕赤酵母分泌表达得到纯度大于97%的HSA-IFN-α2b。

测定其体外活性为未融
合IFN-α2b活性的1.4%。

食蟹猴皮下注射后，与IFN疗效正相关的2′,5′-OAS
表达显著增加；其在体内活性可维持14d，较IFN-α2b有明显提高。

Zhao等[10-11]发现HSA-IFN-α2b易形成二聚体，导致产物复性率仅为10%，
且产物需制成冻干粉保存。

位点突变研究证明，HAS可能影响了IFN-α2b的
Cys1和Cys98二硫键的稳定性。

改变融合蛋白中两分子的链接顺序将IFN-α2b
的C端与HSA的N端基因相连，得IFN-α2b-HSA。

其复性率为25%，半衰期
为50h，37℃溶液条件下可长时间保持良好的均一性和稳定性。

但经加速力学和
热效应进一步测试发现，IFN-α2b-HSA倾向通过错误的二硫键形成聚合物，而聚合物会增加药物的免疫原性。

通过点突变将非对称Cys替换为Ser，构建IFN-
α2b-HSA（C345）。

实验表明，C345和IFN-α2b-HAS拥有相似的药代动力学
行为。

通过72h的加速搅拌实验、60℃的2h孵育之后，有超过90%的C345仍
保持着单体结构。

其复性率和稳定性的提高使得制备HSA融合IFN制剂成为可能。

人IgG免疫球蛋白是人体的主要抗体，因其Fc片段可与新生Fc受体结合，避免IgG进入溶酶体中被降解，半衰期可长达20d。

王磊等[12]构建了IFN-α2b与人lgG不同亚型Fcγ片段的融合基因，在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达，并有部分糖基化。

经体外活性检测，融合不同亚型Fcγ的FN-α2b 抗病毒活性均有所降低，其中IFN-α2b-Fcγ2受影响最小，只降低了2.3倍。

大鼠皮下注射后半衰期达65h，约是商品重组干扰素的9倍。

IFN治疗病毒性乙型肝炎时，并不能取得理想治疗效果的原因可能是药物在肝炎病毒主要复制部位——肝脏中分布较少。

所以近年来IFN的另一主要研究方向为靶向修饰，通过将IFN与具有特殊亲和力的载体相连，直接将IFN运送到靶器官，以期拥有少量高效低毒的特性。

另外，IFN-β和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)均为有效抗癌药物，以腺相关病毒(AAV)为载体，构建联合重组病毒也是靶向治疗肿瘤的有效手段。

去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGP-R）又名肝凝集素（liver lectin），仅存在于哺乳动物肝细胞膜，能专一性结合末端带有半乳糖残基的糖蛋白并定向转运至胞内。

早在1996年，钟裕国等[13]就利用2-亚胺基-2-甲氧乙基-1-硫代半乳糖苷与蛋白质一级氨基偶联，将2～3个半乳糖残基引入IFN-α1分子上，制备了半乳糖基
α1-干扰素（IFN-α1-Gal），核素示踪法结果显示IFN-α1-Gal较未修饰IFN-α1具有明显趋肝性，且效价提升了2.77倍。

但IFN-α上仅含有10个Lys，可用于糖基化的更少，采用这种糖基化方法，一般只能连 2～3个半乳糖分子，使IFN的靶向性受到了限制。

近年，采用半乳糖化血清白蛋白（含有69个Lys）为载体，有效解决了这一问题。

与双功能试剂2-亚胺基-2-乙氧基-1-半乳吡喃糖苷共价连接，Cai等[14]得到了偶合物G-HSA-IFN，该分子上连有大约24个硫代半乳糖。

其抗病毒活性较HSA-IFN并未明显增加，但体内分布研究表明，G-HSA-IFN具有显著趋肝性(>45%/g)，加之具有HSA-IFN的长效性特点，临床前景良好。

二硫键稳定性Fv抗体（disufide-stabilized Fv fragments，dsFv）是近年发展起来的新型基因工程抗体，具有分子小，稳定性好，生物活性高等特点。

宋宏彬等[15]通过筛选噬菌体抗体库得到人源抗HBsAg基因工程抗体，采用定点突变获得二硫键稳定性Fv抗体，将其轻链基因与IFN融合后，与重链基因分别构建真核表
达载体，共同转染CHO后，得到了兼有抗HbsAg活性和IFN活性的融合蛋白。

2010年，江乐[16]等在此基础上，如图2所示，在重链基因3′端融入一段带正电荷的DNA负载区（与这一段基因融合表达，将使目的蛋白带正电荷，能结合带负电的质粒DNA），再将dsFv抗体的轻链和重链两部分基因通过自身切割肽F2A 连接置于同一开放读码框，克隆入高效真核表达载体pEE14·1，获得重组表达质粒pEE14·1-dsFvαpr+并在CHO中表达。

后续计划与带负电荷的HBV治疗性DNA 疫苗通过静电作用耦合，制备抗体靶向纳米颗粒。

IFN-β和TRAIL都是抗癌药物。

AAV为目前最有应用前景的基因转移载体之一。

Wang等[17]利用AAV携带IFN-β和TRAIL基因并置于hTERT启动子控制下构建成肿瘤靶向病毒即AAV-hTERT-IFN-β-TRAIL联合病毒。

对比单一治疗对A549肺癌细胞的体内外生长抑制情况，联合病毒可增强肿瘤细胞毒性和凋亡诱导效应，疗效更好。

这一研究提供了新的肿瘤靶向双基因治疗策略。

IFN抗肿瘤抗病毒为医学界公认，而最新基因工程修饰手段对于IFN更广泛的应用有重要意义。

文中所提到改善IFN特征的主要技术手段及其修饰后产品如表1所示。

修饰后常见问题为体外活性下降，这通常是蛋白活性位点被修饰剂阻挡导致的，可通过修饰产物半衰期的延长和增大给药量来补偿。

连上大分子外源物质PEG的IFN，难以透入组织深处易导致复发率上升；而糖基化干扰素的体内分布同未修饰IFN没有区别[5]，白蛋白修饰干扰素也有广泛的体内分布[18]且生物相容性好。

文中提到的一些新研究仍处于临床前实验的不同阶段，但现有的优越成果已为后续IFN修饰技术探索提供了基础和思路。

可以预见，蛋白质工程干扰素制品拥有乐观的应用前景。

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