一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810968554.9
(22)申请日 2018.08.23
(71)申请人 潍坊市康华生物技术有限公司
地址 261023 山东省潍坊市经济开发区月
河路699号
(72)发明人 杨致亭　唐玉蓉　马金环　朱元祺　
王婷　
(74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理
事务所(普通合伙) 11411
代理人 苏友娟
(51)Int.Cl.
G01N 33/577(2006.01)
G01N 33/569(2006.01)
G01N 33/535(2006.01)
(54)发明名称一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺(57)摘要本发明公开了一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺，本发明为HCMV重组抗原S(pp150862-1048+gp52297-433+pUL57545-601)用于检测人巨细胞病毒IgM和IgA的ELISA试剂盒，包括包被鼠抗人-IgM 单克隆抗体的酶标板和包被HCMV重组抗原S的酶标板，以及辣根过氧化物酶标记的HCMV重组抗原S和标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体。

其中，包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板用于检测HCMV IgM抗体，包被HCMV重组抗原S的酶标板用于检测HCMV IgA抗体。

本发明试剂具有较好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性，且操作方法简便，标
准易于控制。

权利要求书2页 说明书7页 附图1页CN 109298181 A 2019.02.01
C N 109298181
A
1.一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒，其特征是：包括包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板和包被HCMV重组抗原S的酶标板、辣根过氧化物酶标记的HCMV重组抗原S和标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照和阳性对照。

2.一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的制备工艺，其特征是：所述包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板的制备方法是：用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液将鼠抗人-IgM单克隆抗体稀释至合适浓度，然后再包被到空白的酶标板上，达到最佳的包被效果；
所述辣根过氧化物酶标记的重组蛋白S的制备方法是：
A.HCMV重组蛋白S的获取
(1)根据NCBI中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV(pp150+gp52+pUL57)基因编码序列，人工合成基因pp150的aa862-1048、gp52的aa297-433以及pUL57的aa545-601序列，三种基因之间用G4S链接子连接，将其克隆到PET28a载体上，并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE鉴定；
(2)将表达HCMV重组蛋白S的大肠杆菌大量培养，诱导，收集菌体，超声破碎并离心收集上清，镍柱层析纯化后得到大量HCMV重组蛋白S；
B.辣根过氧化物酶标记HCMV重组抗原S：
(1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
(2)加入0.2ml新配的0.1M过碘酸钠(NaIO4)溶液，室温下避光搅拌20min，然后装入透析袋中，对1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(3)加20μl 0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg重组抗原S，室温避光轻轻搅拌2h；
(4)加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠NaBH4溶液，混匀，放置4℃2h，然后装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；
(5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；
3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH 7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000r/min离心30min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存；
所述包被重组抗原S的酶标板的制备方法是同包被鼠抗人-IgM单克隆抗体方法。

所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体的制备方法是：采用过碘酸钠法将抗体与HRP偶联，具体方法同重组抗原S标记方法。

3.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述检测HCMV IgM使用的阳性对照为含HCMV IgM抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgM阴性的血清；所述检测HCMV IgA使用的阳性对照为含HCMV IgA 抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgA阴性的血清；标本稀释液为含10％胎牛血清的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液；显色液为TMB-H2O2尿素溶液；终止液为2M的硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺，其特征在于：所述重组蛋白S的氨基酸序列如SEQ No.1所示。

5.根据权利要求1所述的一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试
剂盒及其制备工艺，其特征在于：所述重组蛋白S的核苷酸序列如SEQ No.2所示。

一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试
剂盒及其制备工艺
技术领域
[0001]本发明涉及一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺。

背景技术
[0002]人类巨细胞病毒(HCMV)是一种广泛感染人类的β-疱疹病毒。

虽然一般成人感染HCMV后无症状或症状较轻，但是孕妇感染后常造成流产、死胎、胎儿畸形和发育迟缓等严重后果，而在免疫功能受到抑制的个体(如器官移植受者)中，HCMV常引起致死性感染。

因此早期、快速、准确地诊断HCMV活动性感染具有重要意义。

[0003]感染HCMV后人体免疫系统会产生多种抗体，如IgA、IgM、IgG等。

HCMV-IgM和HCMV-IgA型抗体是病毒抗原刺激机体后最早出现的抗体,是HCMV急性期感染的标志，因此开发人巨细胞病毒IgA、IgM抗体的检测试剂,有助于早期诊断和发现HCMV感染，对后期的治疗和预后至关重要。

[0004]目前HCM V早期感染的临床诊断主要用ELISA检测血清中特异性抗体IgM,但常用的ELISA试剂盒多以成分复杂的全病毒为抗原，与其他疱疹病毒属的病毒存在交叉反应,导致检测试剂盒的特异性及敏感性差别较大，易造成假阳性和假阴性结果，进而影响到不同临床感染阶段的HCMV诊断,极易造成漏诊和误诊。

利用基因工程方法构建HCMV重组抗原以取代全病毒抗原，可大大提高检测的特异性和敏感性；因此研发重组抗原HCMV的ELISA-IgM 检测试剂盒可提高临床检测的灵敏度和特异度，此外，辅助检测IgA可进一步提高诊断的灵敏性，降低漏诊率。

[0005]pp150属于HCMV包膜蛋白，与其他疱疹病毒蛋白无同源性，该蛋白至少有两个抗原决定簇，位于C端的862-1048氨基酸和495-691氨基酸；gp52和pUL57是DNA结合蛋白，其中gp52能被绝大多数HCMV阳性血清识别，其IgM抗原决定簇在297-433氨基酸；pUL57的抗原决定簇主要位于545-601氨基酸和C端的1144-1196氨基酸，与pp150和gp52相比，pUL57能更早的识别IgM抗体，因此更有利于急性期IgM的检测，然而，目前检测HCMV IgM使用的重组抗原主要是pp150和gp52，其敏感性和特异性都有待提高。

基于此，我们将pp150、gp52与pUL57的优势抗原表位联合表达(pp150862-1048+gp52297-433+pUL57545-601)，获得重组蛋白，用该蛋白作为捕获法检测IgM抗体；此外，利用间接法检测IgA抗体，可进一步提高HCMV急性期的诊断率。

发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA 试剂盒及其制备工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的ELISA试剂盒及其制备工艺，其特征是：包括包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的
酶标板和包被HCMV重组抗原S的酶标板，以及辣根过氧化物酶标记的HCMV重组抗原S和标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体；此外，还包括标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照和阳性对照。

[0008]一种用重组抗原检测人巨细胞病毒IgM和IgA抗体的制备工艺，所述包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板的制备方法是：用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液(包被缓冲液)将鼠抗人-IgM单克隆抗体稀释至合适浓度，然后再包被到空白的酶标板上，达到最佳的包被效果；[0009]所述辣根过氧化物酶标记的重组蛋白S的制备方法是：
[0010] A.HCMV重组蛋白S的获取
[0011](1)根据NCBI中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV(pp150+gp52+pUL57)基因编码序列，人工合成基因pp150的aa862-1048、gp52的aa297-433以及pUL57的aa545-601序列，三种基因之间用G4S链接子连接，将其克隆到PET28a载体上，并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE鉴定；
[0012](2)将表达HCMV重组蛋白S的大肠杆菌大量培养，诱导，收集菌体，超声破碎并离心收集上清，镍柱层析纯化后得到大量HCMV重组蛋白S；
[0013] B.辣根过氧化物酶标记HCMV重组抗原S：
[0014](1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
[0015](2)加入0.2ml新配的0.1M过碘酸钠(NaIO4)溶液，室温下避光搅拌20min，然后装入透析袋中，对1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
[0016](3)加20μl 0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg重组抗原S，室温避光轻轻搅拌2h；
[0017](4)加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH4)溶液，混匀，放置4℃2h，然后装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；
[0018](5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；
[0019]3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH 7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000r/min离心30min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存；
[0020]所述包被重组抗原S的酶标板的制备方法是同包被鼠抗人-IgM单克隆抗体方法；[0021]所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体的制备方法是：采用过碘酸钠法将抗体与HRP偶联，具体方法同重组抗原S标记方法。

[0022]作为本发明的进一步改进，所述检测HCMV IgM使用的阳性对照为含HCMV IgM抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgM阴性的血清；所述检测HCMV IgA使用的阳性对照为含HCMV IgA抗体的人血清；阴性对照为临床上确诊为HCMV IgA阴性的血清；标本稀释液为含10％胎牛血清的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液；显色液为TMB-H2O2尿素溶液；终止液为2M的硫酸溶液。

[0023]作为本发明的进一步改进，所述重组蛋白S的氨基酸序列如SEQ No.1所示。

[0024]作为本发明的进一步改进，所述重组蛋白S的核苷酸序列如SEQ No.2所示。

[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可以准确快速诊断出样品是否为HCMV IgM阳性；本发明与国内外同类试剂盒比较，特异性为100％，敏感性为99.3％。

由于本发明结合检测IgM和IgA，其特异性和敏感性均高于国内某公司生产HCMV IgM试剂盒(分别
为97％和89.1％)，尤其是敏感性大大提高。

附图说明
[0026]图1为重组蛋白S的基因电泳图(泳道1为marker，泳道2、3为重组蛋白基因)；[0027]图2为重组蛋白S的SDS-PAGE电泳图(泳道1为marker，泳道2、3为串联表达重组蛋白的BL21)。

具体实施方式
[0028]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029]请参阅图1-2所示：
[0030]实施方式1
[0031]采用捕获法检测人巨细胞病毒IgM抗体，本发明所述的巨细胞病毒IgM抗体检测试剂盒，包括包被鼠抗人-IgM单克隆抗体的酶标板、HRP-S、洗涤液、标本稀释液、显色液、终止液，阴性对照和阳性对照。

[0032]一、HCMV重组抗原S的制备
[0033]1、确定优势抗原表位
[0034]根据NCBI中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV(pp150+gp52+pUL57)基因编码序列，通过软件分析确定基因优势抗原表位，然后人工合成基因pp150的aa862-1048、gp52的aa297-433以及pUL57的aa545-601序列，三种基因之间用G4S链接子连接。

[0035] 2.目的DNA片段插入表达载体
[0036]将PET28载体与目的DNA双酶切，酶切产物跑电泳后切胶回收，经T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌BL21,涂布于含有氨苄抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，次日挑取平板上的单菌落置LB液体培养菌中生长，然后提取质粒，酶切鉴定。

[0037] 3.重组蛋白S诱导表达
[0038]将含有重组质粒的菌株接种到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，待菌株生长到OD值为0.5左右加IPTG诱导表达5h，收集菌体，超声破碎，离心后，上清经镍柱层析纯化，然后SDS-PAGE鉴定。

[0039]二、辣根过氧化物酶标记重组抗原S
[0040] 1.称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
[0041] 2.加入0.2ml新配的0.1M过碘酸钠(NaIO4)溶液，室温下避光搅拌20min，然后装入透析袋中，对1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
[0042] 3.加20μl、0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg重组抗原S，室温避光轻轻搅拌2h；
[0043] 4.加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH4)溶液，混匀，放置4℃2h，然后装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；
[0044] 5.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；
[0045] 6. 3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH 7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

[0046]三、测定鼠抗人-IgM单克隆抗体最适包被浓度
[0047]利用棋盘法测定包被抗体的最适浓度
[0048] 1.用包被液将抗体原液(0.05μg/μl)分别稀释成0.04μg/ml、0.03μg/ml、0.02μg/ ml、0.01μg/ml、0.009μg/ml、0.008μg/ml、0.007μg/ml、0.006μg/ml、0.005μg/ml、0.004μg/ ml，每孔加入100μl进行包被、洗涤；
[0049] 2.将强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清用稀释液按10倍递增系列稀释并加样、洗涤；
[0050] 3.加入最适浓度的HRP-S，37℃孵育并洗涤；
[0051] 4.加显色液显色，加终止液后酶标液读取OD450值；
[0052] 5.选择强阳性血清的OD值为0.8-1.0之间，阴性血清的OD值小于0.1的包被抗体的稀释度作为最适浓度，为0.007μg/ml。

[0053]四、鼠抗人-IgM单克隆抗体酶标反应板包被
[0054]用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液(包被缓冲液)将鼠抗人-IgM单克隆抗体稀释至蛋白质含量为0.007μg/ml，在酶标板孔中加100μl，置4℃过夜，弃去孔内液体，PBST洗板5次后拍干；然后用含10％胎牛血清的PBS封闭，37℃放置1h(每孔100μl)，PBST洗板5次。

[0055]五、HRP-S最适浓度测定
[0056] 1.包被鼠抗人-IgM单克隆抗体(0.007μg/ml)；
[0057] 2.将强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清用稀释液按10倍递增系列稀释并加样、洗涤；
[0058] 3.将重组抗原S(2.4μg/μl)作一系列稀释后加入到包被孔中，孵育洗涤；[0059] 4.加显色液显色，终止液终止反应，测定OD450值，选择强阳性血清的OD值为0.8-1.0之间，阴性血清的OD值小于0.1的HRP-S的稀释度作为最适浓度，为0.01μg/ml。

[0060]六、HCMV-IgM检测试剂盒具体操作方法如下：
[0061]1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15min以上；
[0062]2)浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
[0063]3)取标本稀释液100μl(2滴)于各酶标板的反应孔中，空白及阴、阳对照孔不加；[0064]4)去10μl待测标本加于反应孔内，用移液器反复吹打，孔内液体变为蓝色，阴、阳性对照孔各加100μl阴、阳性对照，空白孔空置；
[0065]5)将反应板振荡30s使样品充分混匀，置37℃反应20min；
[0066]6)取出酶标板，用应用洗涤液洗涤5次，拍干；
[0067]7)每孔加入酶结合物50μl(1滴)，空白孔不加，轻轻振荡混匀，置37℃反应20min；[0068]8)取出酶标板，用应用洗涤液洗涤5次，拍干；
[0069]9)加入底物液A 50μl、底物液B 50μl(各1滴)，空白孔不加，轻轻振荡混匀，置37℃反应10min；
[0070]10)取出板后加50μl(1滴)终止液，空白孔不加，在酶标仪上，于波长450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍数，即为阳性。

[0071]实施方式2
[0072]采用间接法检测人巨细胞病毒IgA抗体。

本发明所述的巨细胞病毒IgA抗体检测试剂盒，包括包被HCMV重组抗原S的酶标板、HRP-鼠抗人-IgA单克隆抗体、浓缩洗涤液、标本稀释液、底物液A、底物液B、终止液，阴性对照和阳性对照。

一、HCMV重组抗原S的制备
[0073]方法同上。

[0074]二、辣根过氧化物酶标记鼠抗人-IgA单克隆抗体
[0075] 1.称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；
[0076] 2.加入0.2ml新配的0.1M过碘酸钠(NaIO4)溶液，室温下避光搅拌20min，然后装入透析袋中，对1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
[0077] 3.加20μl 0.2M、pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg抗体，室温避光轻轻搅拌2h；
[0078] 4.加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH4)溶液，混匀，放置4℃2h，然后装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；
[0079] 5.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；
[0080] 6. 3000r/min离心30min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH 7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

[0081]三、测定重组抗原S最适包被浓度
[0082]利用棋盘法测定包被抗体的最适浓度
[0083] 1.将重组抗原S(2.4μg/μl)作一系列稀释后加入到包被孔中，孵育洗涤；[0084] 2.将强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清用稀释液按10倍递增系列稀释并加样、洗涤；
[0085] 3.加入最适浓度的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体，37℃孵育并洗涤；
[0086] 6.加显色液显色，加终止液后酶标液读取OD450值；
[0087]7.选择强阳性血清的OD值为0.8-1.0之间，阴性血清的OD值小于0.1的包被重组抗原S的稀释度作为最适浓度，为0.01μg/ml。

[0088]四、重组抗原S酶标反应板包被
[0089]用pH9.0、0.05M碳酸盐缓冲液(包被缓冲液)将重组抗原稀释至蛋白质含量为0.01μg/ml，在酶标板孔中加100μl，置4℃过夜，弃去孔内液体，PBST洗板5次后拍干；然后用含10％胎牛血清的PBS封闭，37℃放置1h(每孔100μl)，PBST洗板5次。

[0090]五、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体最适浓度测定
[0091] 1.包被重组抗原S(0.01μg/ml)；
[0092] 2.将强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清用稀释液按10倍递增系列稀释并加样、洗涤；
[0093] 3.将辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体(1.5μg/μl)作一系列稀释后加入到包被孔中，孵育洗涤；
[0094] 4.加显色液显色，终止液终止反应，测定OD450值，选择强阳性血清的OD值为0.8-1.0之间，阴性血清的OD值小于0.1的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人-IgA单克隆抗体的稀释
度作为最适浓度，为0.008μg/ml。

[0095]六、HCMV-IgA检测试剂盒具体操作方法如下：
[0096]1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15min以上；
[0097]2)浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
[0098]3)取标本稀释液100μl(2滴)于各酶标板的反应孔中，空白及阴、阳对照孔不加；[0099]4)取10μl待测标本加于反应孔内，用移液器反复吹打，孔内液体变为蓝色，阴、阳性对照孔各加100μl阴、阳性对照，空白孔空置；
[0100]5)将反应板振荡30s使样品充分混匀，置37℃反应20min；取出酶标板，用应用洗涤液洗涤5次，拍干；
[0101]6)每孔加入酶结合物50μl(1滴)，空白孔不加，轻轻振荡混匀，置37℃反应20min；[0102]7)取出酶标板，用应用洗涤液洗涤5次，拍干；
[0103]8)加入底物液A 50μl、底物液B 50μl(各1滴)，空白孔不加，轻轻振荡混匀，置37℃反应10min；
[0104]9)取出板后加50μl(1滴)终止液，空白孔不加，在酶标仪上，于波长450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍数，即为阳性。

[0105]本发明中所述的重组蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)：
[0106]DDVVSPATSPLSMLSSASPSPAKSAPPSPVKGRGSRVGVPSLKPTLGGKAVVGRPPSVPVSGSAPGRLS GSSRAASTTPTYPAVTTVYPPSSTAKSSVSNAPPVASPSILKPGASAALQSRRSTGIAAVGSPVKSTTGMKTVAFDL SSPQKSGTGPQPGSAGMGGAKTPSDAVQNILQKIEKIKNTEGGGGSGSLSSLANAGGLHDDGPGLDNDIMNEPMGLG GLGGGGGGGGKKHDRGGGGGSGTRKMSSGGGGGDHDHGLSSKEKYEQHKITSYLTSKGGSGGGGGGGGGGLDRNSGN YFNDAKEESDSEDSVTFEFVPNTKKQKCGGGGGSGVPGGGAGGGGGRDVSGGPSDGLGGGRGGGGGGDSGGMMGRGG RMLGASVDRTYRLN
[0107]本发明中所述的重组蛋白的DNA核苷酸序列(SEQ No.2)
[0108]gatgatgtcgtgtcccctgccacatcgccgctgtccatgctttcgtcagcctctccgtccccggccaa gagtgcccccccgtctccggtgaaaggccggggcagccgcgtcggtgttccttccttgaaacctactttgggcggc aaggcggtggtaggtcgaccgccctcggtccccgtgagcggtagcgcgccgggtcgcctgtccggcagcagccggg ccgcctcgaccacgccgacgtatcccgcggtaaccaccgtttacccaccgtcgtctacggccaaaagcagcgtatc gaatgcgccgcctgtggcctccccctccatcctgaaaccgggggcgagcgc ggctttgcaa
[0109]tcacgccgctcgacggggatcgccgccgtaggttcccccgtcaagagcacgacgggcatgaaaacggt ggctttcgacttatcgtcgccccagaagagcggtacggggccgcaaccgggttctgccggcatggggggcgccaaa acgccgtcggacgccgtgcagaacatcctccaaaagatcgagaagattaagaacacggagggaggcggaggtagtg gcagcctctcttcgctggctaatgccggcggtctgcacgacgacggcccgggtctggataacgatattatgaacga gcccatgggtctcggcggtctgggaggaggtggcggcggtggcggcaagaagcacgaccgcggtggcggcggtggt tccggtacgcggaaaatgagcagcggtggcggcggcggtgatcacgaccacggtctttcctccaaggaaaaatacg agcagcacaagatcaccagctacctgacgtccaaaggtggatcgggcggcggcggcggaggaggaggcggcggttt ggatcgcaactccggcaattacttcaacgacgcgaaagaggagagcgacagcgaggattctgtaacgttcgagttc gtccctaacaccaagaagcaaaagtgcggcggaggcggaggtagt
[0110]ggggttccgggcggcggtgctggcgggggtggtggacgggacgtgagcgggggcccgagcgacggtct gggcggcggtcgtggtggtgggggtggcggggattccgggggaatgatggggcgcggcggtcgcatgctgggcgct
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[0111]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

图1图2
说　明　书　附　图1/1页CN 109298181 A 11。