蛋白质组学-LDH

基因组告诉你，理论上能够发生什么？ mRNA告诉你，可能发生什么？ 蛋白质组告诉你，正在发生什么？
3.1.2 蛋白质组
• 蛋白质组（proteome） ： 1994年，由Marc Wilkins首次提出，指由 一个基因组(genOME)，或一个细胞、组 织表达的所有蛋白质(PROTein)。
3.1.3 蛋白质组学
• ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation mass spectrometry ）
MALDI
利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基 质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一 步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。
MALDI 最大的特点是离子电荷通常为1-2个， 而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样 品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图 谱的解析比较清楚。
Mass Analyzer
Sort Ions by Mass (m/z)
Detection
Ion Detector
Detect ions
Inlet
• Solid • Liquid • Vapor
100 75 50 25
0 1330
1340
1350
Mass Spectrum
主要质谱类型
• MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸/电离飞行时 间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)
或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、 膜蛋白、核蛋白等）---- 提高低丰度蛋白质的上 样量及检测灵敏度。 尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分 辨率。
样品分离
• 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）：利用蛋白质的 等电点与分子量差异分离之。
• 第一向：等电聚焦 IEF 第二向：SDS-PAGE
第一向 等电聚焦IEF
第二向 SDS-PAGE
染色方法
• 考马斯亮蓝染色 • 银染（不含戊二醛） • 荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标
记等
2-DE 的缺点
• 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极 小蛋白质，及低丰度蛋白质。
• 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自 动化联用。
新型非凝胶技术
• 液相色谱法（liquid chromatography, LC） LC-MS/MS：液质联用技术
• 对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、 低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋 白进行有效的分离鉴定。
Cell culture
2-DE
Protein extraction
Image analysis
staining
Scanning
微量测序（microsequencing）
• N-末端 Edman 降解：经凝胶分离的蛋白质直接 印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上 → N末端氨基酸 残基经苯异硫氰酸酯修饰 → 从多肽链上切下修饰 的残基 → 再经层析鉴定 → 余下的多肽链被回收 再进行下一轮降解循环。
• 蛋白质组学（proteomics）： 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态 变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰 状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系， 在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的 活动规律。
• 功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一 生理现象相关的所有蛋白质。
• 差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样 本之间蛋白质组的区别与变化。
• 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。
质谱分析（Mass spectrometry）
• 基本原理：样品分子离子化后，根据离子 间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分 子量。
Ionization
Ion Source
Form ions (chargeLeabharlann Baidu molecules)
Mass Sorting (filtering)
蛋白质组学 Proteomics
刘丹慧 温州医学院检验医学与生命科学学院
前言与背景
蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生 命活动的实际执行者。
几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成 细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白 质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨； 肌肉大部分也是由蛋白质组成。
ESI
待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。 在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发， 其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一 临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。
➢ 电喷雾源(ESI)的特点
没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较 少，是一种典型的“软电离”方式。 可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大 分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质
3.2 蛋白质组学的研究
• 多样----蛋白质数目大大超过基因数目。 • 可变----蛋白质随时间与空间变化。
3.2.1 蛋白质组学研究的基本流程
• 基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广 泛的、发展最为成熟的工作流程
2-DE & MS
样品制备
• 样品来源：细胞、组织、体液等。 • 可采用全蛋白；
蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链， 肽链再折叠形成一定空间结构。
3 billion bases
~28,000 genes > 100,000 proteins
人类基因组中绝大部分基因及其功能有 待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。
基因组
转录组
蛋白质组
The era of ‘omics’-based science （组学时代） – Genomics （基因组学） – Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） –Transcriptomics（ 转录组学） –Proteomics （蛋白质组学） –Metabonomics/metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学） –Aim - 3D structures of all protein folds !