对流免疫电泳解析
免疫学对流免疫电泳
快。在抗体和抗原的对向泳动时，两者相遇于最适比例处
形成白色沉淀线，可肉眼观察得到结果，此结果为阳性结 果。
电渗作用（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼 脂是酸性物质，在碱性缓冲液中带负电，而与它接触的 溶液带正电，因此液体向阴极移动，产生电渗）
【材料】
1.
正常人血清 兔抗人血清，等电点：8.0
实验内容
对流免疫电泳
【原理】
对流免疫电泳（CIEP）： 基于抗体抗原的等电点彼此不 通，在通电的琼脂凝胶中抗体向负极泳动，抗原向正极泳 动。一般抗体（IgG）的等电点位pH5~9,血清蛋白抗原的
等电点位pH4~5,所以在pH8.2~8.6的缓冲溶液中，抗体所
带的负电荷较少，正电荷较多,同时还受电渗作用，向负极 泳动；抗原带正电荷少负电荷多，分子也较小，电泳迁移
3、抗原、抗体的量应相接近，如抗原量过多，可造成
假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。 4、电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉
断；过低时沉淀线出现时间会延长
2.
3.
0.05UpH8.6巴比妥钠—盐酸缓冲液、生理盐水
1 %离子琼脂板用0.05U巴比妥钠—盐酸缓冲液配成 打孔器、图样板、毛细吸管 电泳仪，电泳槽
4.
5.
6.
【步骤】
制离子琼脂板 先用生理盐水 50 ml加1.2 g琼脂 隔水煮沸融化， 再加 50 ml pH8.6 0.05 mol/L巴比妥缓 冲液继续隔水煮 沸至澄清，取融 化的琼脂3.5～ 4 ml，浇于载玻 片上，待其冷却
打孔 （孔径3mm,孔距3mm） 加样 对应孔号加试剂
放入电泳槽
开启电泳仪 调整电压为30V 电流强度为6~8mA 通电1h 电泳完毕 取出琼脂板 观察实验结果
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳（immunoelectrophoresis）是一种将免疫反应与电泳结合起来的方法，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在和浓度。
其原理包括以下步骤：
1. 样品制备：将待测样品中的抗原或抗体进行提取和纯化。
2. 准备电泳板：将琼脂糖凝胶块放置在电泳板上，形成一条凹槽。
在凹槽两侧分别插入两个电极。
3. 样品加载：在凹槽中将待测样品和免疫球蛋白（常常是抗体）混合，形成样品准备。
4. 电泳：将电泳板放置在含有适当缓冲液的电泳槽中，通电使得样品准备在凝胶上进行电泳运动。
根据样品带电性质的不同，抗原和抗体会在电场作用下向正或负极运动。
5. 免疫沟槽：当样品准备在电场作用下运动时，抗原和抗体会形成一定的沟槽，其中抗原移动的远一侧为阳极端，抗体移动的远一侧为阴极端。
6. 静置：在电泳完成后，允许抗原和抗体在凝胶中进行免疫反应。
抗原与抗体之间的特异性结合会形成可见的免疫沉淀线。
7. 结果解读：根据免疫沉淀线的形状、长度和强度，可以判断待测样品中特定抗原或抗体的存在和相对浓度。
总的来说，流免疫电泳的原理是在电泳过程中，利用抗原与抗体之间的特异性结合作用使其在电场作用下形成免疫沉淀线，并通过观察和解读沉淀线的特征来进行分析和定量。
对流免疫电泳实验原理
对流免疫电泳实验原理
嘿，朋友们！今天咱来聊聊对流免疫电泳实验原理。
这玩意儿啊，就像是一场奇妙的舞蹈比赛！
想象一下，在一个特殊的舞台上，有两种选手，一种是抗原选手，另一种是抗体选手。
这个舞台呢，就是电泳槽啦。
抗原选手们和抗体选手们平时都好好地待在自己的位置上，互不干扰。
可一旦我们通上电，这就好比给这场比赛吹响了开场哨！抗原选手们因为各自的特点，就开始顺着电场的方向跑起来啦。
这时候，抗体选手们也不甘示弱呀，它们也顺着电场开始行动。
那场面，就跟两支队伍在比赛谁跑得快似的。
但是呢，有趣的事情发生啦！当抗原选手和抗体选手在电场中相遇的时候，哇哦，那可不得了！它们就像遇到了久别重逢的老友一样，紧紧地拥抱在一起。
这一拥抱可不简单呐，这就是我们能看到的沉淀线呀！就好像是这场舞蹈比赛中最精彩的部分，让我们一眼就能看到它们相遇的美妙瞬间。
你说神奇不神奇？这就是对流免疫电泳的魅力所在呀！通过这样一个看似简单的过程，却能让我们清楚地看到抗原和抗体之间的反应。
而且哦，这个实验就像是一个神奇的魔法，能帮我们解开好多生物谜题呢！它能告诉我们身体里的免疫系统是怎么工作的，能帮我们检测疾病，是不是超级厉害？
我们平时生活中可能不太会注意到这些小小的抗原和抗体，但在这个实验里，它们可成了大主角呢！就像我们每个人在自己的生活中都是主角一样。
所以啊，对流免疫电泳实验原理真的很有趣，也很重要呢！它让我们看到了微观世界里那些奇妙的互动和反应。
让我们更加了解生命的奥秘呀！这不就是科学的魅力所在嘛！大家说是不是呀！。
免疫学实验 对流免疫电泳
1
Ab
2 Ag
3
Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照）
2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清
电泳
• 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置 负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分 别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓 冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度 计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计 算，为6V/cm；通电30-60min后，切断 电源，观察结果
实验二 对流免疫电泳
一、实验目的 1.掌握对流免疫电泳的原理。 2.掌握对流免疫电泳检测待测抗原的方法。
二、实验原理
• 对流免疫电泳实质上是定向加速的双向免 疫扩散技术。
• 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电 荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由 于分子量大，暴露的极性基团较少，在离 子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影 响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比 例处形成乳白色沉淀线。
四、实验步骤
• 琼脂糖凝胶板的制备 • 打孔、加样 • 电泳 • 结果观察 • 影响结果的因素
制板、加样、打孔
• 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片 上,待凝。
• 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm), 如图。
• 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔 内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但 不能溢出
五、结果和讨论
• 将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与 抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待 检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出 现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性， 否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察。
甲胎蛋白检测意义：
对流免疫电泳
对流免疫电泳概述对流免疫电泳（convection-enhanced immunoelectrophoresis，CEIE）是一种以免疫电泳技术为基础的新型免疫分析技术，也称作免疫对流电泳。
该技术利用特定的对流流动作用，使电泳操作更加稳定和方便，并能够大幅提高样品的灵敏度和准确性。
同时，对流免疫电泳也逐渐被应用于多项临床和实验室检测任务中。
原理对流免疫电泳是一种以聚丙烯凝胶为基质，将试验物聚焦于水平位移平衡的技术。
在试验过程中，聚丙烯凝胶中的样品水平运动会被一个垂直方向的空气流覆盖，形成对流效应，从而使凝胶样品的水平位移保持平衡。
该对流效应可以削减因重力差异而导致的样品层析效应，使得电泳分离更为稳定和准确。
此外，对流免疫电泳还采用一些辅助技术以增强其灵敏度。
例如，将电泳板倾斜，或者增加凝胶浓度都可以提高对流免疫电泳的敏感度。
这些辅助技术都能帮助样品快速进入凝胶中，并且更快速地与抗体结合。
应用对流免疫电泳在临床检测中已经得到了广泛的应用。
例如，对于一些癌细胞检测任务中，样品比较粘稠，传统的免疫电泳无法满足敏感度和特异性要求。
然而，通过使用对流免疫电泳技术，可以更加容易地进一步提高检测的精度和准确性。
此外，对流免疫电泳还可以应用于其他生物样品的检测中，如血清、尿液、脑脊液等。
因此，它在计量、生物药物、食品等许多其他领域也得到了广泛的应用。
优点和局限性对流免疫电泳技术有许多明显的优点。
首先，该技术能够提高样品的敏感度和特异性，从而确保测试结果更加准确和可靠。
其次，对流免疫电泳具有快速的操作速度，并且可靠性较高。
此外，这种技术对富含粘稠物的样品也非常适用。
因此，这种技术受到了广泛的青睐。
尽管对流免疫电泳技术存在很多优点，但仍然存在一些局限性。
例如，在一些情况下，可能会出现样品重叠和遮挡的现象，使得检测时出现误差。
此外，这种技术的设备和实验室条件要求较高，操作工作复杂，具有很高的技术门槛。
因此，在操作过程中必须掌握相关的技术。
对流免疫电泳
对流免疫电泳对流免疫电泳（⼀）原理将抗原和抗体分别加⼊半固体琼脂孔内，在碱性缓冲液中进⾏电泳时，蛋⽩质抗原带负电荷，在电场中由阴极向阳极移动。
抗体等电点较抗原⾼，在此缓冲液中带阴离⼦少，分⼦量⼤，泳动较慢，同时因电渗作⽤（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根，在碱性缓冲液中带负电，⽽与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产⽣电渗），反⽽向阴极泳动，这样就使抗原、抗体在电场中相对移动，⽽形成对流。
经过⼀定泳动时间后，在⽐例最适处，形成⾁眼可见的⽩⾊沉淀线。
由于电场作⽤，限制了抗原和抗体多⽅向的⾃由扩散，加速了泳动的速度，缩短了反应时间，提⾼了灵敏度。
（⼆）器材与试剂1．器材（1）电泳仪、电泳槽（2）载玻⽚（3）刻度吸量管（4）打孔器和图形卡（5）⽑细管（6）吸⽿球（7）煮沸消毒⽔浴箱2．试剂（1）1.2％琼脂凝胶（2）⽣理盐⽔（3）抗原（4）抗体（5）pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液（三）操作步骤：1．取热熔的1.2％琼脂凝胶3.5ml，⽴即浇于载波⽚上，使琼脂平铺于整个玻⽚。
待⾃然冷却凝固。
2．⽤打孔器按图形打孔，再⽤针尖挑去孔内琼脂。
3．将抗原和抗体⽤⽣理盐⽔分别稀释成1:8浓度。
4．⽤⽑细管按顺序将抗原加⼊第1孔中。
将抗体加⼊第2孔中。
每孔加满为⽌，（注意防⽌溢出孔外）。
5．将琼脂凝胶玻⽚放⼈pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液的电泳槽中，抗原端接负极，抗体端接正极，琼脂两端⽤四层纱布搭桥。
6．电泳，电压为110V，泳动时间30－45分钟。
7．关闭电源。
8．观察结果：从电泳槽内取出琼脂板，对光观察抗原与抗体之间有否⽩⾊沉淀线，出现沉淀线最佳⽐例和最⾼稀释度是多少，并绘出沉淀线的位置、数量、形态。
（四）注意事项1．浇板时，琼脂⾯要铺平。
2．加样时避免样品溢出孔外。
对流免疫电泳
抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补 体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用 已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知 的抗原检测未知的抗体。
免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记 技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原 抗体反应的敏感性。
抗原-抗体反应的特点:
1. 特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合 2. 可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键
②试管凝集试验：半定量实验
已知Ag定量测Ab 用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列 稀释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定 时间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度 定量测定血清中的Ab水平及其效价。
试管凝集试验
管号
1
2
盐水(mL) 0.5 0.5
血清(mL) 0.5 0.5
抗原(mL) 0.5 0.5
• 加样：用微量加样器取Ag（人血清）20 μL分别 加于阴极侧1、2、3、4孔内，阳极侧5、6、7、8 各孔均加抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜， 但不可溢出孔外。
• 电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸 或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，Ab端 接正极电源。按电场强度4~6 V/cm电泳50 min左 右。
①单向免疫扩散
[原理]
将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含 Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量 的Ag加入孔中。
Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知 的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复 合物所形成的白色沉淀环。
沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同 浓度的标准Ag与固定浓度的Ab抗体反应后测得 沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可 绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从 标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定 抗原或IgG、 IgM、 IgA。
实验2 对流免疫电泳
琼脂扩散技术 ●双向琼脂扩散:
将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向 四周扩散，在二者比例合适处形成白色沉淀线。
●单向琼脂扩散:
将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验步骤
制板
3－4ml 琼脂
打孔
加样 (5-6ul)
抗体 原倍
抗体 1:2
抗原 抗原
抗体 1:4
抗体 1:8
抗原 抗原
电泳（100V, 30min)
制板与打孔 取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml均匀 浇注于玻片上(注意不要让琼脂凝掉），厚度约1.5~2.0mm。 待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔，。
思考题
1.将抗原稀释不同比例后，实验结果有何差异？出现 差异的原因是什么？ 2.实验过程中应该注意什么问题？
请在下周上课前交齐本次实验报告
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
电泳
带电颗粒在电场作用下，向 着与其电性相反的电极移动。
影响电泳迁移速度的因素： 1、带电颗粒的性质：电荷多、分子小泳动快 2、溶液中pH值： pH值离pI越远，解离多，电荷多泳动快 3、电渗作用 4、溶液的离子强度：低离子强度时，迁移速度快 5、电场强度：单位厘米的电位差 越大泳动快 6、吸附作用：介质对样品的滞留作用拖尾
一般抗原蛋白质带负电 荷，虽然也受电渗作用的 影响，但它的电泳迁移率 远远大于电渗作用。
电场力
电渗力
负
极
抗原
正
抗体
极
将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在 两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可 见的沉淀线。
沉淀反应——对流免疫电泳
沉淀反应——对流免疫电泳沉淀反应是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的分子或蛋白质。
通过反应产生的沉淀可以进一步用于分析、鉴定等目的。
对流免疫电泳是一种结合了沉淀反应和电泳技术的新型方法，可以用于快速、高效地检测特定抗原或抗体在复杂混合物中的存在与浓度。
在下面的文中，我将介绍一些与对流免疫电泳相关的内容。
1. 对流免疫电泳的原理对流免疫电泳是一种将免疫学反应与电泳技术结合的方法。
该方法基于抗原和抗体之间的特异性识别，通过在电泳过程中形成免疫复合物，使目标物质在电场作用下沉淀成固定位置的条带。
该原理可以用以下步骤描述：样品中的抗原与标记化的抗体结合，形成抗原-抗体复合物；电泳平台上的固相区域覆盖着特定抗原或抗体的亲和剂，使复合物与固相结合；施加电场使复合物向电极移动，过程中，复合物和非特异性物质会发生竞争，仅有特异性物质能够形成沉淀条带。
2. 对流免疫电泳的优势对流免疫电泳具有许多优势，使其在生物医学研究领域得到广泛应用。
首先，对流免疫电泳是一种高度特异性的检测方法，能够对目标物质进行高效的富集和分离，同时避免非特异性的干扰。
其次，对流免疫电泳具有较高的灵敏度和准确性，能够在样品中检测到非常低浓度的抗原或抗体。
此外，对流免疫电泳是一种快速的分析方法，通过合理的实验设计和条件优化，可以在短时间内完成样品的检测和分析。
最后，对流免疫电泳不需要昂贵的设备和专门的实验技术，具备较低的成本和操作的简便性，使其具有良好的实用性和广泛的应用前景。
3. 对流免疫电泳的应用领域由于对流免疫电泳的优势，它在许多领域都得到了广泛的应用。
首先，对流免疫电泳在生物医学研究中常被用于分析和检测血清中的特定抗原或抗体，帮助诊断和监测各种疾病。
其次，对流免疫电泳在药物研发和生物制药领域也得到了应用，用于药物代谢产物、细胞毒性物质和蛋白质的分析。
此外，对流免疫电泳还可用于农业生物技术、食品安全和环境监测等方面的研究，用以检测农药残留、食品中的有害物质和环境中的污染物。
沉淀反应——对流免疫电泳
沉淀反应是一种常见的实验方法，广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
对流免疫电泳是一种利用沉淀反应来检测特定抗体或抗原的方法。
本文将从沉淀反应和对流免疫电泳的原理、原料准备、实验步骤、结果解释等方面进行详细介绍。
1.沉淀反应的原理沉淀反应是指溶液中两种物质（通常是抗原和抗体）结合形成可视的沉淀物。
在免疫电泳中，抗原和抗体的结合是基于亲和力原理，即抗原和抗体之间的特异性结合。
通过进行沉淀反应，可以将待测物质与其他不相关的物质分离出来，并产生可见的沉淀带。
2.对流免疫电泳的原理对流免疫电泳是在电场的作用下，通过对流的形成将沉淀反应进行分离和检测的方法。
其原理基于电泳迁移率的差异。
在电场作用下，凝胶中的带电物质会向电极迁移，迁移速率取决于其电荷量、分子大小和凝胶孔道大小。
通过对凝胶中不同带电物质的迁移情况进行观察，可以进行沉淀反应的定性和定量分析。
3.原料准备进行对流免疫电泳需要准备以下原料：•小的平行板电泳槽：用于放置凝胶和进行电泳。
•聚丙烯酰胺凝胶：用于分离待测物质。
•抗原和抗体：待检测的特定抗原和相应的抗体。
•缓冲溶液：调节pH值和离子浓度，以维持免疫反应的条件。
•对流带电盐（例如亚硝酸钠）：用于产生对流效应，加速免疫反应的结果显示。
4.实验步骤（1）制备凝胶：按照聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，制备适当浓度和凝胶浓度的凝胶。
（2）样品制备：将待测物质（抗原）与其相应的标记物质（例如酶）结合，以便在凝胶上形成可见的沉淀带。
（3）电泳：将凝胶浸入电泳槽中的缓冲溶液中，施加恒定电场进行电泳。
（可根据实验要求进行冲洗和固化等步骤）（4）对流实验：在电泳进行的过程中，添加适量的对流带电盐到电泳槽中，观察沉淀带在凝胶中的迁移情况。
（5）结果解释：通过观察凝胶上的沉淀带的位置、形状和强度，可以判断特定抗原和抗体的有无、浓度以及亲和力的强弱。
5.结果解释对流免疫电泳的结果解释主要依赖于沉淀带的位置、形状和强度。
例如，如果在观察的凝胶中出现一个明亮且窄的沉淀带，通常表示特定抗原和抗体之间有很强的亲和力，即表明样品中含有特定抗原。
对流免疫电泳(免疫学实验)
对流免疫电泳
实用文档
一、基本原理
在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的 负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作 用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时， 反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电 荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳 动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极， 抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间 后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地 方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不 仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且 也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾 向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏 度要高10～16倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白 的定性和半定量测定。 实用文档
二、对流免疫电泳
即双扩+电泳术 用途：同双扩 优点：快、敏感性高 缺点：分辨力低
实用文档
三、操作方法
1．制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成 1%～1.5%琼脂凝胶板，厚度2mm～3mm。 2．打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列， 孔径0.3cm～0.6cm，孔距0.4cm～1.0cm。挑去孔内 琼脂，封底。 3．加样 一对孔中，一孔加抗原，另一孔加抗体。 4．电泳 将抗原孔置于负极端。电流强度3mA/cm～ 6mA/cm，电泳时间30min～90min。
实用文档
实用文档
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四、结果观察 断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景 观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条 清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰， 可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳 槽过夜再观察。
对流免疫电泳实验报告
对流免疫电泳实验报告
本实验旨在探究对流免疫电泳技术在生物医学领域中的应用，以及其在分析蛋白质和其他生物大分子方面的优势。
对流免疫电泳是一种结合了电泳和免疫学原理的新技术，通过对样品进行电泳分离，并利用抗体特异性识别目标蛋白质，从而实现对蛋白质的定量和定性分析。
实验中，我们首先准备了样品，包括目标蛋白质和其他可能存在的干扰物质。
然后，我们将样品加载到对流免疫电泳仪中，通过电场力和对流效应使样品在凝胶中进行分离。
接着，我们使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
在电泳结束后，我们进行染色和成像，观察并记录样品的分离情况。
实验结果显示，对流免疫电泳技术能够有效地分离出目标蛋白质，并且具有较高的灵敏度和特异性。
与传统的凝胶电泳相比，对流免疫电泳技术能够更快速、更准确地分析样品中的蛋白质成分，同时避免了凝胶电泳中可能出现的假阳性和假阴性结果。
此外，对流免疫电泳技术还可以应用于生物医学研究和临床诊断中。
通过对样品中蛋白质的定量和定性分析，可以帮助科研人员更好地理解生物学过程，发现新的生物标志物，为疾病诊断和治疗提供重要参考。
因此，对流免疫电泳技术具有广阔的应用前景。
总的来说，对流免疫电泳技术作为一种新型的生物分析方法，具有许多优势，包括高灵敏度、高特异性、快速分析速度等。
在未来的研究和应用中，我们可以进一步优化实验条件，拓展对流免疫电泳技术的应用领域，为生物医学领域的发展做出更大的贡献。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理对流免疫电泳的原理1. 引言对流免疫电泳（Capillary Electrophoresis-Immunosorbent Assay，CE-ISA）是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
其原理基于离子迁移和免疫反应的相互作用，可以快速、准确地检测和定量分析目标分子。
2. 原理介绍对流免疫电泳主要由免疫反应和电泳分离两个步骤组成。
在电泳毛细管内涂覆一个特定抗原或抗体（通常是抗体）的固相材料，以形成免疫反应界面。
当样品中的目标分子与固相材料上的特异抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
通过施加电场，驱动这些复合物在电泳毛细管内进行迁移分离。
3. 免疫反应对于对流免疫电泳，关键的一步是选择和固定特异性抗体或抗原在固相材料上，以确保特异性的免疫反应。
这样可以确保目标分子与固相材料上的抗体结合，从而形成抗原-抗体复合物。
4. 电泳分离电泳分离是对流免疫电泳的核心步骤。
通过施加电场，使复合物在电泳毛细管内迁移。
复合物的迁移速度受到多种因素的影响，如电场强度、毛细管尺寸、载流液和样品pH等。
这些因素的调节可以实现目标分子的高效分离和定量测量。
5. 优势与应用对流免疫电泳具有许多优势。
该方法具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的分子。
对流免疫电泳快速、自动化，适用于大规模样品分析。
该方法可以分析多种复杂样品，如血清、尿液和细胞提取物等，并广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。
6. 个人观点和理解对流免疫电泳是一种非常有潜力的生物分析方法。
其结合了电泳技术和免疫分析原理的优势，可以在较短的时间内准确地检测和定量分析目标分子。
这种方法在生物医学、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
然而，对流免疫电泳方法仍需进一步的改进和优化，以提高其灵敏度和稳定性，并解决样品预处理和复杂样品矩阵的干扰等问题。
总结对流免疫电泳是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
医学免疫学：对流免疫电泳
主要的试剂和器材
• 抗原：AFP • 待测抗体：抗AFP？ • 巴比妥缓冲液 • 1.5%琼脂（巴比妥缓冲液配制） • 载玻片、打孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
实验步骤
• Байду номын сангаас板 用10ml的移液管取4.5ml 1.5％琼 脂巴比妥缓冲液，浇于洁净的载玻片上， 待其冷凝。
• 打孔 用打孔器打孔，如图。孔间距 10mm。挖取孔中的琼脂。
• 微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。
中央偏左
• 加样 (如图）每孔加样10μι。 • 电泳 接通电源，电压100～120V，电泳1h。
加抗原 加抗体
实验现象
• 抗原与抗体两孔之间形成沉淀线。 • 画出实验现象。 • 如果有沉淀线，则说明待测标本中含有与
抗原相对应的抗体（即抗AFP）。
注意事项
• 浇制琼脂板时，要均匀、平整、薄厚一致，无 气泡，布满整张玻片。
• 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。搭桥时， 应注意纱布与凝胶接触紧密，否则会是电流不 均匀，导致沉淀线歪斜、不均匀。
• 打孔时，注意孔间距离为小于等于10mm，不 能太大，否则在本实验规定的电压和时间内电 泳不会出现沉淀线，需要加大电压和/或加长电 泳时间。
• 电泳完毕，应先断开电源，在取出电泳板，以 防止积蓄电压触电。
打孔时注意孔间距离为小于等于10mm不能太大否则在本实验规定的电压和时间内电泳不会出现沉淀线需要加大电压和或加长电泳时间
对流免疫扩散
实验原理
• 对流免疫电泳实验时将双向免疫扩散与电 泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。蛋 白质抗原、抗体在电场中作定向加速免疫 双扩散，从而加速沉淀线的形成。
• 在偏碱性的缓冲液环境和适当的直流电场 中，大部分抗原带负电荷，向阳极移动； 而抗体大部分是IgG，其等电点与环境中的 pH接近，故极性基团解离很少；另外，由 于其分子量大，加上电渗作用使其缓慢向 阴极移动，在一定时间内（30min90min），抗原与抗体两孔之间或抗体的 另一侧形成沉淀线。
对流免疫电泳+血型鉴定
一.对流免疫电泳（1）实验原理带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动的方向与胶体颗粒所带的电荷有关，抗原在PH8.6的缓冲液中带负电荷，故由阴极向阳极移动，抗体球蛋白的等电点为PH6-7，故在PH8.6的缓冲液中带负电荷少，且分子较大，移动缓慢，同时因电渗作用，反向阴极移动，于是形成抗原与抗体相对移动的情况，在二者相遇的最适比例处产生白色沉淀。
此种在双向免疫扩散的基础上加电泳的方法称为对流免疫电泳。
由于抗原、抗体在电场中做定向移动，限制了琼脂双向扩散时抗原、抗体朝各方向自由扩散，因而提高了实验的敏感度，且沉淀线出现较快。
可在1小时内观察结果，故可作快速诊断。
（2）材料1.抗体：甲胎蛋白（AFP）诊断血清2.抗原：甲胎蛋白3.0.05M巴比妥缓冲液（PH8.6）4.1.25﹪缓冲琼脂5.电泳仪一套6.玻片，打孔器，10ML微量加样器（3）操作步骤融化的缓冲液琼脂倒板↓微量加样器加抗原，抗体↓注意勿产生气泡电泳60min↓抗原接阴极，抗体接阳极观察结果（4）实验结果（用实验照片展示）（5）讨论1.血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。
但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。
所以游动慢。
更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。
所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。
琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。
抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。
而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。
这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。
2.影响结果的因素（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。
当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。
医学免疫学实验二 对流免疫电泳
双向琼脂扩散试验:
➢ 将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中 ，二者会向四周扩散，在二者比例合适处 形成白色沉淀线。
免疫电泳技术 Immunoelectrophoresistechnique
➢ 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis ，CIEP）：即双扩+电泳，具有快、高敏感等优点， 但分辨力低。
琼脂扩散试验
➢ 定义：可溶性抗原与抗体在含有电解质的半固体 凝胶(琼脂/琼脂糖)中进行的一种免疫沉淀试验。 琼脂起到网架作用，其含水量高达99%使可溶性 抗原与抗体在其间可以自由扩散，若抗原与抗体 比例合适，在相遇处可形成白色沉淀线，称阳性 反应。沉淀线在凝胶中可长期保持原位并可经染 色后干燥保存。
琼脂凝胶
pH 8.6
0.05M 巴比妥缓冲液:
巴比妥
1.84g
巴比妥钠 10.3g
加蒸馏水至1000ml
调pH至8.6
蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较 稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比 妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白由于等 电点的原因一般都带负电荷。
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，具有下列优点： ➢ 琼脂含98-99%液体，近似自由电泳，但是样品的扩散度
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者 则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。
思考：
1）对流免疫电泳的注意事项
2）如果结果没有出现白色沉淀线，该做何分析
请在下周上课前交齐本次实验报告。
➢ 沉淀线(带)对抗原与抗体具有特异的不可透性， 而非特异者则否。所以一个沉淀线(带)即代表一 种抗原与抗体的沉淀物。
项目五对流免疫电泳试验
项⽬五对流免疫电泳试验项⽬五对流免疫电泳试验 (Counter immunoelectrophoresis test)【实验原理】在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作⽤下能相对移动，所以⼆者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度⽐例合适之处形成⽩⾊沉淀线。
据此临床常⽤该⽅法检测抗原，以诊断某些疾病。
【试剂和器材】1．AFP 阳性⾎清、待检⾎清、抗AFP 诊断⾎清。
2． mol/L 巴⽐妥缓冲液。
巴⽐妥钠 10.3 g巴⽐妥 1.84 g先将巴⽐妥置于三⾓烧瓶中，加⼊200ml 蒸馏⽔，加热溶解后再加⼊巴⽐妥钠，最后加蒸馏⽔⾄1000ml 。
3．琼脂凝胶按需要量称取琼脂粉，加⼊ L 巴⽐妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L ，沸⽔浴中溶解⾄澄清。
4．电泳仪、电泳槽、万⽤电表。
5．载玻⽚、绘图笔尖、吸管、滴管等。
【步骤和⽅法】1．制备琼脂凝胶板取溶化的琼脂3~4ml ，浇于载玻⽚上，冷却后打孔。
2．打孔⽤绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm ，孔距4~5mm ，挑去孔中凝胶。
3．加样⽤滴管按图1-6分别加⼊抗⾎清、AFP 阳性⾎清、待检⾎清，以加满孔为宜，注意不要溢出。
4．电泳将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端，两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。
按通电源，将电压控制在4~6V/cm 长，或电流3~4mA/cm 宽，电泳30~60min 。
【结果判定】电泳完毕后关闭电源，待15~30min 后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染⾊后保存。
阳性对照孔与抗⾎清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。
待检⾎清孔与抗⾎清孔之间出现⽩⾊沉淀线为阳性，不出现者为阴性。
Ag Ag Ab Ab +_1 阳性对照孔2~4 待检⾎清孔图1-6 对流免疫电泳【注意事项】1．当标本为脂⾎症、陈旧⾎标本或由于α2-巨球蛋⽩可引起假阳性，它靠近阳极呈弧状。
对流免疫电泳
鸡传染性法氏囊病对流免疫电流一对流免疫电泳是利用电场力的作用和抗原抗体特异性结合的原理发展起来的一种快速诊断方法，与传统的琼脂凝胶沉淀实验相比。
它具有快速，敏感、特异等优点。
我们利用自制的诊断抗原、抗体建立了鸡传染性法氏囊病的对流免疫诊断方法。
建立诊断鸡传染性法氏囊病的对流免疫电泳（CIE）技术。
实验结果证明，该法的敏感性较琼脂凝胶沉淀实验至少高4倍，并具有快速敏感特异等特点。
鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种有传染性法氏囊病毒引起的急性高度传染性疾病。
肉鸡感染后死亡率很高，通常死亡率约为10％--90％，如有发其他疾病，则死亡率更高。
早起快速准确的诊断是防止本病的基础。
二材料与方法自制的抗原抗体(一)电泳琼脂板的制备1 先用蒸馏水配1﹒5％琼脂糖，水浴加热融化后，加入1/2量的预热至70 ℃左右0.075mol/L、PH 8、6的巴比妥缓冲液。
最终琼脂糖为1％，PH 8、6，离子强度0,025 mol/L，混合后趁热铺于干净的载玻片上（7．5cm×3．5cm），厚3mm。
注制板前载玻片一定要洗干净，在4℃下处理10—20min.加琼脂时动作要快，使琼脂间不要出现明显的界限。
2 冷凝后打2行3列相对的孔，孔径3mm，孔距5mm，行距4mm，在相对2孔内分别加入抗原和抗体。
加样后，至于电泳槽中进行电泳。
电泳用缓冲液为0.05M巴比妥缓冲液（PH 8.6）.将抗原孔端置于阴极，血清端置于阳极。
每端分别以2—3层滤纸为桥侵入电泳液内，以每毫米宽2—3mA的电流通30—60min。
在抗原孔和血清孔之间出现的白色沉淀判为阳性。
另外，在观察对流免疫电泳结果时，电泳完毕后最好再经生理盐水漂洗30min，则更易判定。
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武汉大学基础医学院 免疫学教研室 熊洁
实验原理
对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳技术的 结合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中带有电荷， 在电场作用下可发生定向移动。将Ag、Ab分别加 在pH为8.6缓冲液琼脂中电泳，因各种血清蛋白质 都带负电荷，泳向阳极。由于电渗作用，液体则 流向阴极，二者方向相反。
终体积(mL) 1.0 1.0
稀释度
1:20 1:40
结果
++++ +++
3
4
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1:80 1:160
++
++
5 0.5 0.5 0.5 1.0 1:320
+
6
7
0.5 0.5
0.5 弃 0
0.5 0.5
1.0 1.0
1:640 盐水对照
-
-
效价—— 能与定量Ag产生明显凝集现象（++）的血清 最高稀释倍数 。
• 电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，在黑色背景 下观察，凡AgAb孔间出现白色沉淀线者为阳性， 孔间无白色沉淀线者为阴性。如沉淀线不清晰可 将琼脂板置37℃温箱数小时后再进行观察，也可 染色观察。
• 在Ag与Ab孔间出现沉淀线者为阳性。沉淀线形 状、位置等差异，与Ag、Ab浓度及分子量有关。
相关知识
径3 mm，孔距5 mm。
_
+
_
+
15
37
15
37
26
100 V
48
50 min
26
48
• 加样：用微量加样器取Ag（人血清）20 μL分别 加于阴极侧1、2、3、4孔内，阳极侧5、6、7、8 各孔均加抗体（抗人血清）。加样量以孔满为宜， 但不可溢出孔外。
• 电泳：琼脂板放入电泳槽内，琼脂板两端用滤纸 或纱布与缓冲液相接，Ag端接负极电源，Ab端 接正极电源。按电场强度4~6 V/cm电泳50 min左 右。
Ab带负电荷少，分子量大，所以电泳力小于电渗 力，向阴极移动。而Ag所带负电荷多，分子量较 小，故其电泳力大于电渗力，向正极移动。
如Ag、Ab相应，相遇，在比例适当时即形成 白色沉淀线。由于电场限制了AgAb分子的自由扩 散，因而提高了试验的敏感性(提高10~20倍)，并 缩短了反应时间（与双向琼脂扩散相比）。同双 扩，可定性确定抗原含量。
2、间接凝集
将可溶性Ag（或Ab）包被在惰性颗粒载体 （红细胞、乳胶颗粒等）表面，再与相应Ab（或 Ag）反应，出现颗粒物凝集的现象。
（二）沉淀反应 定义：可溶性Ag（如血清蛋白、细胞裂解液或
组织液等）与相应Ab特异性结合，在一定条件下， 免疫比浊 • 琼脂凝胶扩散： ①单向免疫扩散 ②双向免疫扩散 ③对流免疫电泳 ④火箭电泳 ⑤免疫电泳
材料
• 抗原：待测人血清 • 抗体：抗人血清 • 巴比妥缓冲液（0.05 mol/L, Ph 8.6）、1.5%巴比妥
缓冲离子琼脂 • 其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管、
电表
方法
• 制板：取4 ml 煮沸的1. 5％ 巴比妥琼脂，立即浇 注在玻片上，制成厚薄均匀的琼脂板
• 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器按下图打孔，孔
②试管凝集试验：半定量实验
已知Ag定量测Ab
用已知的定量的颗粒性Ag悬液直接与系列稀 释的待检血清（Ab）在试管内混合，经一定时 间后，观察各管有无凝集，并根据凝集程度定量 测定血清中的Ab水平及其效价。
试管凝集试验
管号
1
2
盐水(mL) 0.5 0.5
血清(mL) 0.5 0.5
抗原(mL) 0.5 0.5
①单向免疫扩散
[原理]
将某种特异性Ab混合于琼脂凝胶中，制成含 Ab的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的 Ag加入孔中。
Ag在孔中向四周作辐射状扩散，如Ag与已知 的Ab相对应，在两者比例适合处出现由免疫复合 物所形成的白色沉淀环。
沉淀环直径的大小与Ag的含量成正比。以不同 浓度的标准Ag与固定浓度的Ab抗体反应后测得 沉淀环的直径作为横坐标，以Ag浓度为纵坐标可 绘制标准曲线。根据待测样本沉淀环的大小，从 标准曲线中即可推算其含量。主要用于定量测定 抗原或IgG、 IgM、 IgA。
结合 3. 阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段
特异性结合阶段 可见的反应阶段 4. 比例性：抗原和抗体结合是否呈现可见的反应 现象与两者的分子比例密切相关
抗原-抗体反应受多种因素影响 1 . 电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠
作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。
2 . 温度：一般使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。
抗原-抗体反应包括凝集反应、沉淀反应、补 体结合反应和中和反应等。 抗原-抗体反应可用 已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知 的抗原检测未知的抗体。
免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技 术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗 体反应的敏感性。
抗原-抗体反应的特点:
1. 特异性：抗原-抗体的结合是特异性结合 2. 可逆性：抗原抗体结合是分子表面的非共价键
3. 酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6~8。
（一）凝集反应 定义：是颗粒性Ag（如完整的细菌、细 胞）与相应
Ab，在适当条件下，出现肉眼可见的凝集物现象。
方法：直接凝集（玻片凝集、试管凝集） 间接凝集
1、直接凝集
①玻片凝集：定性实验，已知Ab测未知Ag
用于细菌和血型鉴定
玻片凝集反应是在玻片上将抗体直接与颗粒 性抗原物质（如细菌、红细胞等）混合，在有适 当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异 性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如 两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
in the Ab-containing semisolid medium
3. Precipitation Reac
-> The area is proportional to the conc. of Ag.
The region of equivalence
②双向免疫扩散
[原理]
将可溶性Ag和Ab分别加到琼脂板上相应的小 孔中，使两者各自向四周扩散，若Ag与Ab相对 应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合 处形成白色沉淀线。每一对应Ag和Ab可出现一 条沉淀线，根据沉淀线的有无、位置、形状以及 对比关系，可分析Ag或Ab成分。