关于半抗原制备的小结.
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介Last revision date: 13 December 2020.常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、4度搅拌12小时7、静置10小时（4度）8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
半抗原的设计、修饰及人工抗原的制备
半抗原的设计、修饰及人工抗原的制备宋娟;王榕妹;王悦秋;唐雨榕;邓安平【摘要】制备具有良好免疫原性的人工抗原是建立测定小分子化合物的免疫分析方法的最关键步骤.本文对半抗原的设计、修饰(修饰位点的选择、修饰物的制备、连接臂的选择)、载体的选择、半抗原与载体的偶联(偶联方式、偶联条件、最佳偶联率)、人工抗原的纯化与鉴定等方面作了详细的介绍.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2010(038)008【总页数】8页(P1211-1218)【关键词】半抗原;人工抗原;设计;修饰;免疫分析;评述【作者】宋娟;王榕妹;王悦秋;唐雨榕;邓安平【作者单位】四川大学化学学院,成都,610064;四川大学化学学院,成都,610064;四川大学化学学院,成都,610064;四川大学化学学院,成都,610064;四川大学化学学院,成都,610064【正文语种】中文免疫分析是以抗原与抗体之间特异性识别和可逆性结合反应为基础的痕量分析方法,已在临床分析和生物分析中得到广泛应用。
免疫分析不仅适用于大分子化合物 (如蛋白质、核酸、细菌)的检测,也适用于小分子化合物(如激素、药物)的测定。
由于免疫分析具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点,它在环境和食品安全等分析领域中的应用备受关注[1]。
近年来,针对环境和食品样品中的农药[2]、兽药[3-4]、环境激素[5]、毒素[6]及违禁食品添加剂[7]等小分子化合物残留量的免疫分析方法的应用实例较多。
建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制备出对小分子化合物具有高亲和力和高选择性的抗体。
由于大多数农药、兽药等为小分子化合物 (分子量小于 1000),不具有免疫原性,即缺乏 T细胞表位而无法直接诱导动物机体等产生特异性抗体,故小分子化合物被称为半抗原。
然而,半抗原可以通过适当的化学修饰方法,在其分子结构的某个位置上,带上端基为活性基团的连接臂,再与大分子载体结合,生成半抗原-载体的偶联物,此偶联物即为人工抗原,它可以借助 T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖及分化,产生特异性抗体[8]。
关于半抗原制备的小结
关于半抗原制备的小结第一篇：关于半抗原制备的小结关于半抗原制备的小结小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。
以前查过一些材料，作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。
1、对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH2，COOH，OH等活性基团，可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。
但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。
例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。
2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。
但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。
这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。
同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。
3、如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。
待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。
在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
抗原制备的实验报告
一、实验目的1. 掌握抗原的制备方法，了解不同类型抗原的制备和纯化技术；2. 熟悉常用佐剂的使用；3. 学习玻璃器材的清洁和消毒方法；4. 培养实验操作技能和实验数据处理能力。
二、实验原理抗原是指能够引起机体产生特异性免疫反应的物质。
在抗原制备实验中，我们需要从生物样品中提取目标抗原，然后对其进行纯化和处理，使其具有良好的免疫原性和特异性。
三、实验材料1. 生物样品：细菌、病毒、细胞、组织等；2. 试剂：细胞裂解剂、超声破碎剂、离心机、玻璃器材、消毒液、佐剂等；3. 仪器：显微镜、离心机、分光光度计、移液器、培养箱等。
四、实验步骤1. 样本处理（1）取适量生物样品，用无菌操作技术进行接种；（2）根据样品类型，选择合适的裂解方法，如细胞裂解、超声破碎等；（3）裂解后，将样品置于离心机中，以适当转速和时长进行离心，收集上清液。
2. 抗原提取（1）取上清液，加入适量的缓冲液和离心机，以适当转速和时长进行离心；（2）收集沉淀，加入适量的缓冲液，进行溶解；（3）重复离心，直至沉淀完全溶解。
3. 抗原纯化（1）根据抗原特性，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等；（2）将溶解的抗原加入纯化柱，进行洗脱和收集；（3）根据需要，可进行多次纯化，以提高抗原纯度。
4. 抗原处理（1）将纯化后的抗原加入适量的佐剂，进行免疫原性增强；（2）将抗原与佐剂混合均匀，备用。
5. 实验结果观察（1）通过观察显微镜下的细胞形态，了解抗原制备过程中的细胞状态；（2）通过分光光度计检测抗原浓度，了解抗原纯化效果；（3）通过实验数据分析，评价抗原制备的成功率。
五、实验结果与分析1. 样本处理过程中，细胞形态良好，无污染现象；2. 抗原提取过程中，上清液清晰，无沉淀；3. 抗原纯化过程中，纯化效果良好，抗原浓度达到预期；4. 抗原处理过程中，抗原与佐剂混合均匀，无分层现象；5. 实验数据分析表明，抗原制备成功率较高。
六、实验总结本次实验成功制备了所需抗原，掌握了抗原的制备方法、纯化技术和佐剂的使用。
抗原制备的实验报告
抗原制备的实验报告一、实验目的本实验旨在通过制备抗原，提高对特定免疫原的免疫能力，从而进一步认识抗原的制备和应用。
二、实验原理抗原是一种能够激发机体产生特异性免疫应答的物质，通常可分为低分子量和高分子量两类。
低分子量抗原主要是指药物、激素、有机化合物等，而高分子量抗原主要是指蛋白质、多糖、核酸等。
抗原的制备主要包括以下几个步骤：1. 确定抗原：根据实验目的和需要，选择特定的抗原进行制备。
2. 提取抗原：从生物样品中提取目标抗原，常用方法包括细胞裂解、超声破碎、离心、柱层析等。
3. 纯化抗原：使用柱层析、凝胶过滤等技术，将抗原与其他杂质分离，获得纯净的抗原。
4. 浓缩抗原：将纯净的抗原浓缩至适宜浓度，便于后续实验的使用。
三、实验步骤1. 实验准备：清洗实验器材，并将所需溶液按比例配制好。
2. 抗原提取：取适量的生物样品，如细胞液、血清等，进行裂解或超声破碎，释放抗原。
根据需要，可能需要添加蛋白酶抑制剂、麦芽糖等保护剂。
3. 离心分离：将裂解后的样品进行离心，分离固体残渣和上清液。
上清液中含有目标抗原。
4. 柱层析：将上清液加入已经平衡好的层析柱中，根据抗原的特性选择合适的层析介质，如离子交换层析树脂、亲和层析树脂等。
通过洗脱方法，将抗原与其他成分分离。
5. 浓缩：将洗脱后的抗原溶液经过浓缩处理，以获得适用于后续实验的浓缩抗原。
四、实验结果与分析经过实验制备得到的抗原，经过SDS-PAGE电泳分析可见，目标蛋白条带的浓度较高，且无明显的杂带。
通过浓缩抗原，使其浓度达到1000μg/ml，便于后续实验的使用。
五、实验总结通过本次实验，我们成功地制备了目标抗原，并获得了一定浓度的纯净抗原。
本实验中使用的方法可以适用于其他抗原的制备，同时也了解了抗原的重要性及应用。
实验过程中需要注意对实验器材的清洗和消毒，以避免杂质的污染对抗原制备的影响。
六、参考文献[1] 李晓杰，杨立波，陈薇薇，等. 抗原制备及其在抗体制备与检测中的应用进展[J]. 生物技术通讯，2017，28（6）: 900-905.。
半抗原免疫分析(全面)
(1)放射免疫分析
(radioimmunoassay，RIA)
(2)酶免疫分析
(enzyme immunoassay，EIA)
(3)化学发光酶免疫分析
(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)
(4)荧光免疫分析法
(fluorescence immunoassay，FIA)
农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防 腐剂、植物激素等半抗原
在食品安全、植物学、环境检测 等领域，主要是半抗原类物质。
10
抗体
antibody,Ab
抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。
一、基本概念
1. 抗体（Antibody，Ab）
指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分 化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异 性结合的免疫球蛋白。
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（2）基质干扰的消除
掩蔽剂（缓冲液调整） 样品稀释 样品前处理：净化
50
linked immunosorbent immunoassay)
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ELISA简介
（一） ELISA技术的原理
间接法 夹心法 竞争法
夹心法 Sandwich
竞争法
（二） ELISA所用试剂材料
1、固相 2、酶 3、底物 4、缓冲液 5、仪器
1、固定相
聚次亚乙烯
2、最常用的标记酶
(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在
反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之
后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者
关于半抗原偶联载体的方案 人工抗原的合成是化学免疫的重要问题
关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。
半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体. 2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。
在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。
C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。
3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。
4．(3)G6PDH —Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8) 5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原 4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。
抗原的制备
抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
关于半抗原偶联载体的方案
关于半抗原偶联载体的方案早上起来，一杯咖啡，看着窗外的阳光，心情大好。
今天要写的方案是关于半抗原偶联载体的，这个课题我已经研究了10年，是时候把我的思考整理出来了。
我们得明确半抗原偶联载体的概念。
简单来说，就是将半抗原和载体结合起来，形成一种新的免疫原，用于制备抗体或疫苗。
这个过程涉及到生物化学、分子生物学和免疫学等多个领域，所以方案要尽量全面，又要突出重点。
一、方案背景1.1半抗原概述半抗原，顾名思义，就是只有抗原性而没有免疫原性的物质。
它不能单独引起免疫反应，但可以与载体结合，形成免疫原。
常见的半抗原包括药物、糖类、多肽等。
1.2载体概述载体是具有免疫原性的物质，能够与半抗原结合，形成免疫原。
常见的载体有蛋白质、多聚糖、脂质等。
1.3半抗原偶联载体研究意义半抗原偶联载体在疫苗研发、抗体制备等领域具有广泛的应用前景。
通过半抗原偶联载体，我们可以提高抗原的免疫原性，降低副作用，提高疫苗的疗效。
二、方案目标2.1筛选合适的半抗原和载体2.2优化偶联方法，提高偶联效率2.3评估偶联载体的免疫原性2.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用三、方案实施3.1半抗原筛选3.1.1收集文献，整理半抗原候选物质3.1.2分析候选物质的抗原性和免疫原性3.1.3筛选出具有潜在应用价值的半抗原3.2载体筛选3.2.1收集文献，整理载体候选物质3.2.2分析候选物质的免疫原性和生物相容性3.2.3筛选出具有潜在应用价值的载体3.3偶联方法优化3.3.1分析现有偶联方法的优缺点3.3.2设计新型偶联方法，提高偶联效率3.3.3对比实验，验证新型偶联方法的优越性3.4免疫原性评估3.4.1制备偶联载体3.4.2检测偶联载体的免疫原性3.4.3分析免疫原性结果，优化偶联载体3.5应用研究3.5.1疫苗研发3.5.2抗体制备3.5.3产业化推广四、方案进度安排4.1第一阶段：半抗原和载体筛选（1-3个月）4.2第二阶段：偶联方法优化（4-6个月）4.3第三阶段：免疫原性评估（7-9个月）4.4第四阶段：应用研究（10-12个月）五、预期成果5.1筛选出具有潜在应用价值的半抗原和载体5.2优化偶联方法，提高偶联效率5.3成功制备具有免疫原性的偶联载体5.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用前景这个方案的实施需要团队的共同努力，大家一起加油，争取早日取得突破性成果！注意事项一：半抗原筛选的准确性解决办法：筛选半抗原时，一定要仔细分析文献，避免遗漏任何可能的候选物质。
三唑磷半抗原的制备
三唑磷半抗原的制备说到三唑磷半抗原的制备，很多人可能觉得有点头大，甚至可能会想：“这是什么鬼东西？”别怕！咱们一步一步来，轻松理解，保证让你笑着记住它。
三唑磷是个啥？它是一种有机磷农药，简单说，就是用来杀虫的。
在农业中，三唑磷常常被用来对抗那些让农民伤透脑筋的害虫，保护庄稼不受侵犯。
不过，这种药物用多了，可能会给环境带来麻烦，甚至有点毒性。
所以，科学家就开始琢磨，怎么样用更加安全、精准的方式来检测它的存在，防止它过量使用。
而这时，三唑磷半抗原就登场了。
半抗原听起来很高大上，其实它就是一段“折腾过”的三唑磷分子。
简而言之，半抗原是个不完整的分子，但它还是能引起免疫反应。
科学家们利用这种半抗原，做出一种非常特定的抗体，这个抗体就能帮助咱们检测三唑磷的存在。
说白了，半抗原就是三唑磷的一部分，它能“欺骗”免疫系统，让身体做出反应，最终帮助我们精准检测农药残留。
是不是觉得有点像魔术？别急，后面会更有趣。
接下来的步骤就是制备三唑磷半抗原了，这个过程可不是随随便便就能搞定的，得讲究技巧和耐心。
咱们需要把三唑磷这玩意儿“剁”成一个个小部分，也就是“剪”掉它的某些结构。
为什么要这么做呢？因为完整的三唑磷分子不太容易被免疫系统识别，只有经过拆解、变形之后，免疫系统才能产生反应。
所以，科学家们得把它弄成一种合适的“半成品”，让免疫系统觉得它是个“外来物”，从而启动防御机制，产生抗体。
这个过程其实有点像烹饪，要按照配方来，少了啥或者多了啥，味道就不对。
而要弄出这样的半抗原，化学合成是一个必须的步骤。
这个过程中，化学试剂的选择至关重要。
你想啊，如果试剂选择不当，三唑磷可能就彻底“翻脸”，不再和免疫系统玩耍了。
大家都知道，化学合成可不是简单的加个盐巴那么简单，它得通过一系列反应、净化、提纯，甚至是冷冻、烘干等一大堆复杂的操作。
每一步都得谨慎，差一个环节，成果就得打水漂。
搞不好，还得重新来过，真的是“一失足成千古恨”！弄出来的半抗原就是那种“半成品”，它和完整的三唑磷相比，结构上有所不同，但足够让免疫系统认出它，并产生抗体。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
抗原的制备
抗原的制备
小分子抗原
小分子抗原是指小分子化合物，分子量一般都比较小；通常来说，分子量越大、结构越复杂越容易制备高亲和力的抗体，含有芳香环的小分子更容易引起免疫反应。
同样，小分子化合物必须与载体蛋白偶联才能形成完全抗原作为免疫原，小分子化合物与载体偶联一般需要借助于中间体途径引入一些连接臂或者Linker然后再连接到蛋白质载体上，一般不能直接与其结构上的某个基团直接偶联，如果强行偶联势必改变抗原结构；所以通常是先借以合成中间体然后再制备完全抗原。
金属离子抗原
金属离子的免疫抗原一般是借助于螯合剂来实现的，首先将螯合剂偶联到蛋白载体上，比如BSA和OVA，然后再将离子螯合上去；吉林大学的郝亚明依靠该技术成功制备出镉离子（Cd2+）单克隆抗体。
目前，制备金属离子单抗成功并不多，暨南大学的唐勇教授在这方面积累了很多，目前已经成功制备出汞离子（Hg2+）、镉离子（Cd2+）和铅离子（Pb2+）等单克隆抗体，在环境污染检测方面已开发出胶体金和ELISA试纸条等快速检测产品。
对于此类抗原的制备方法,本书不做过多介绍,如感兴趣可与福因德技术团队共同探讨。
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关于半抗原制备的小结小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药, 这方面的文献也很多。
以前查过一些材料, 作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。
1、对于半抗原结构的选择,如果待测物本身含有 NH2, COOH , OH 等活性基团, 可以利用待测物活性基团加入间隔臂, 然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原, 制备特异性良好的抗体。
但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大, 所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。
例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中, 半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成, 而是采用另一途径, 从起始物重新合成, 这样反而能取得较好的效果, 这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要, 只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。
2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响,在分子量在 111 -1202Da 的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中,半抗原的分子量在 334–374Da 之间时,制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。
但当要检测的小分子化合物的分子量小于 300Da 时, 产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。
这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。
同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响, 有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体, 但从化学合成的角度, 这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂, 所以半抗原结构能否合成出来, 也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。
3、如果待测物结构过于简单,可能也是不能建立免疫检测方法的。
待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构, 甚至含有杂原子, 都能够增加制备出高质量抗体的可能性。
在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中, 对于脂肪酸类物质来说, 如果含有两个以上的羰基, 及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性, 同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为 B 细胞的抗原决定簇, 可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。
再者如果脂肪酸含有平面结构, 也可以作为抗原决定表位,使产生特异性的抗体。
这说明小分子的极性以及不饱和键,苯环结构都可以增强抗原性, 简单的直链结构很难产生特异性很强的抗体, 这也是一般选用直链作为间隔臂的原因。
直链碳链本身的抗原决定性很差, 不会产生针对间隔臂的抗体。
4、合成人工抗原的过程中, 即使半抗原绝大部分的官能团与待测物都是一致的, 它也可能在联入蛋白载体的过程中受到屏蔽作用。
小分子药物在与载体蛋白连接的部位很容易受到屏蔽。
从而产生的抗体就会丧失对那些屏蔽基团的特异性。
确定半抗原不受蛋白的屏蔽作用在人工抗原合成中非常重要, 解决这一问题的最佳方法就是联入间隔臂。
5、间隔臂的连接位点的选择对于抗体质量至关重要,最好不要影响小分子化合物中特征性的基团暴露于免疫 B 细胞的抗原表位, 这也是待测物本身的羧基, 氨基一般不能直接联入间隔臂, 因为这些基团对小分子药物的电性和极性影响非常大。
而且引入的间隔臂不能影响主要基团的电子分布, 例如苯环和其他杂环类的电子分布, 这就要求间隔臂的极性和能量要低, 将对小分子药物的电子排布和空间结构的影响降到最低,从这个角度来说,低能量的直链间隔臂是最佳的选择。
联入间隔臂的半抗原的电子分布与目标待测物的电子特性一致性对抗体针对待测物的特异性至关重要。
6、半抗原间隔臂的连接位点,最好选择极性较低且远离半抗原的特征性结构。
如果待测物的极性较高, 半抗原合成的过程中最好保持其与目标待测物极性的一致性。
人工抗原具有较高的极性,对于引发免疫反应有重要作用。
在结构 3Bentazon 的抗体制备过程中,有三个介入位点。
异丙基远离杂环,是联入间隔臂的理想位点, 可以最小程度的改变待测物的物理和化学特性。
但异丙基是这物质的特异性基团,对于保证制备抗体的特异性很重要,所以不能选择这个位点。
7、 Bentason II位的亚氨基具有很强的极性,如果间隔臂联入这个位点极性将会消失。
这种化合物的衍生物大多为非极性, 如果要制备多残留的抗体, 增加交叉反应率, 这个位点将是理想的间隔臂介入位点。
但对特异性要求高的抗体制备, 就必须要保证半抗原的极性, 所以对于高特异性的抗体制备来说, 这一位点也不适合连入间隔臂。
在 III 位介入直链的间隔臂,可以保证与待测物极性的一致, 而且中性的多甲基直链对杂环的电子排布影响也较小。
试验结果显示 II , III 联入间隔臂制备的抗体对 Bentason 的灵敏度很差, 但是对 II 位氨基衍生的样品的灵敏度高于目标待测物,说明衍生物的非极性是灵敏度高于原形 Bentason 的原因。
这也与 MQCA 抗体对原型药物识别能力较差,但对丁胺衍生后的样品具有高灵敏度的实验结果相一致。
说明半抗原与待测药物电荷状态的一致性, 在这些极性很强的药物小分子免疫残留检测方法中要重点考虑。
但 III 位接入间隔臂的人工抗原制备的抗体的灵敏度与预期不一致,这可能因为再 III 位联入间隔臂时,间隔臂上面自由的羧酸基团可能与 II 位自由的氨基发生偶联,所以 III 位联入间隔臂的人工抗原的极性与目标待测物不一致, 这也是抗体对目标待测物识别能力较差的原因。
在 Eva M.Brun等(2004的实验中,根据待测物杀螟松的结构设计了多种半抗原的组合, 具有特异性的结构的是用椭圆标记出来的, 在连接偶联臂时就要充分考虑暴露这一重要的抗原表位, 研究中通过对比接入偶联臂的不同结构的半抗原,显示充分暴露该结构的 F7半抗原制备人工抗原免疫动物得到的多克隆抗体,具有最好的灵敏度和效价。
8、间隔臂的介入位点,最好远离特征性的基团,而且要尽可能保存特异性较大的杂原子或带侧链的碳链结构,联入的间隔臂最好在苯环或其他杂环的碳原子上, 这样可以最大程度的保证半抗原的极性与目标待测物的一致性, 如果有远离大环的碳链结构, 那么碳链的末端也是一个很好的介入位点, 因为这样的结构对大环的电子排布影响较小。
9、除了间隔臂的接入位点以外,间隔臂本身的结构也是影响半抗原合成是否成功的重要因素。
虽然半抗原接入间隔臂是必要的, 但间隔臂太长会导致半抗原分子的折叠, 使其更接近载体蛋白, 屏蔽作用增强。
一些学者认为理想的间隔臂长度是中度的 3-6个直链碳原子构成,这时得到抗体的灵敏度要高于间隔臂很短的人工抗原制备的抗体(6, 13, 20, 21,但在另外的试验中,使用零间隔臂的免疫原也得到了特异性很好的抗体。
实验中, 在间隔臂介入位点为最佳的时候, 当间隔臂的长度在 2-6之间时, 分别制备了人工抗原, 在载体蛋白以及其他的免疫程序一致的条件下, 不同免疫原产生的抗体在亲和能力和灵敏度方面都没有明显的差异。
也说明在间隔臂长度适中的情况下,间隔臂的长度对免疫检测的灵敏度没有明显的影响。
10、间隔臂的选择, 一般间隔臂要求本身不要产生针对间隔臂的抗体, 而且对半抗原的结构影响要小,并且末端要含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联的活性基团,一般为氨基,羧基,或羟基。
间隔臂与小分子半抗原连接一端,最好以单纯的碳链连接, 如果难以实现也要选择电性较低的连接基团, 试验证明以酰胺键相连接,产生的抗体对间隔臂有很高的亲和系数 .11、有试验表明当联入的间隔臂末端为羟基时, 产生抗体的灵敏度要明显高于相同条件下间隔臂以羧酸基团为末端的人工抗原制备的抗体。
这可能因为含间隔臂半抗原末端不同, 所以与载体蛋白的偶联方式不同, 所以含羟基的半抗原可以提高半抗原与载体的偶联比,并且能够更好的暴露半抗原的抗原决定簇。
12、虽然对于含多个特异性结构的大分子化合物来说, 用含苯环的间隔臂或零间隔臂同样可能制备处特异性好, 灵敏度高的抗体。
但现在很多试验都证明, 选择简单的中长度的碳链对于半抗原合成是最佳选择, 也是小分子药物半抗原合成选择间隔臂的通用方法。
13、用作载体的有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒,常用的有明胶、牛血清白蛋白(BSA 、人血清白蛋白(HSA 、兔血清白蛋白、卵清白蛋白(OVA 、匙孔血蓝蛋白(KLH 等。
选择载体要综合考虑分子量、活性基团、溶解度及来源,价格等因素。
明胶做为载体免疫原性差,需要多次免疫。
匙孔血蓝蛋白(KLH 价格昂贵,虽然免疫原性强,但它激发的 B 淋巴细胞克隆中针对自身抗原决定簇的多, 相对减少了针对半抗原的 B 淋巴细胞克隆, 增加阳性克隆筛选的难度和工作量。
一般认为, 用与免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体可能会更好, BSA 与HSA 都是良好的载体蛋白,均能刺激动物产生特异性抗体,并且 BSA 、 HSA 和OVA 这几种载体分子量适中、来源容易、价格便宜、水溶性好, 故常用作半抗原载体;此外 BSA 、 HSA 和 OVA 都具有大量的反应基团,如氨基、羧基等, 且能在水相或某些有机溶剂的混合物中充分溶解, 使偶联反应可在较高浓度的反应物存在条件下进行,据报道,每分子 BSA 有 60个游离氨基,每分子 OVA 有 20个游离氨基(NCBI 蛋白质数据库可以和合成半抗原的羧基反应形成肽键,合成免疫原。
14、由试验表明在单克隆抗体的制备过程中,脂蛋白-Th 细胞抗原决定基载体蛋白(Pam3Cys-TH 制备抗体的灵敏度高于用 BSA , KLH 作为载体蛋白制备的抗体, 可能因为这种载体蛋白的支链更长。
用 BSA 或 KLH 作为载体制备抗体的亲和力很差,因为分子在体内很快被肾脏系统消除,而新载体 Pam3Cys-TH 就克服了这样的问题。
并且 Pam3Cys-TH 本身就可以做为佐剂使用,所以产生的免疫反应非常强,有利于产生高亲和力的抗体。
因为抗原展示细胞(APC 表面是带负电荷的,通常认为如果载体蛋白经过离子化处理带有正电荷, 就更容易结合到带负电荷的细胞表面, 能引起更强的免疫反应。