第三章 发酵液预处理
发酵液的处理
影响絮凝效果的因素：
1) 絮凝剂浓度
2) 絮凝剂分子量
3) 絮凝剂类型
4) 溶液的pH
5) 搅拌速度和时间
6) 助凝剂
A. 絮凝剂浓度
浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸 附饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。
B. 高分子絮凝剂分子量
分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量 不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂
发酵液的预处理和固液分离方法
山东农业大学 孙中涛
预处理和固液分离的目的：
1、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸 和蛋白质的沉淀物)。
2、除去部分可溶性杂质。
3、改变滤液的性质（降低粘度等），以利于后继操作。
总策略： 1、胞外产物：应尽可能转移到液相中，常 用调pH至酸性或碱性的方法来达到。 2、胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物 质释放到液相，再分离细胞碎片。 3、通常，以含生化物质的液相为出发点，进 行后继操作。
使蛋白质变性的其它办法：
大幅度改变pH，加酒精、丙酮等有机溶剂 或表面活性剂等。
在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性 范围(pH2—3)或较碱性范围(pH 8—9）使蛋白质 凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。
加有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数 量较少的场合。
利用吸附作用除去蛋白质：
举例：
3、采用酶制剂分解黏性物质
如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化
为单糖，以提高过滤速度。 例如：万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过 滤速度加快。
4、染菌发酵液的处理方法
混凝：
阳离子型高分子絮凝剂对带负电菌体或蛋白质来说，同时 具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以 单独使用， 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，主要通过分子间引力 和氢键产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。 首先加入无机电解质，使悬浮粒子脱稳而凝聚，然后，再 加入絮凝剂。凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从 而，提高了絮凝效果。 这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
发酵液预处理及固液分离方法
转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约90°-130°，圆筒缓 慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分 配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、 卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区， 卸渣及再生区3个区域。
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转筒真空过滤机
主要适用霉菌发酵液，对菌体 细小、黏度大铺助滤剂。
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（一） 过 滤 filtration
借助于过滤介质，在一定的压力差作用下， 使 悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被 截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。
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1、滤饼过滤： 介质：滤布，滤饼达到一定厚度起过滤作用。 适用于：固体含量>0.1g/100ml
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过滤推动力：
• 悬浮液自身压强差、重力 • 悬浮液表面加压 • 过滤介质下方抽真空 • 离心力
18
发酵液的预处理和固液分离技术
二 预处理-降低发酵液粘度
方法
提高温度 －确保目的产物稳定性
加水稀释－过滤速度需提高稀释 数倍以上
三 预处理-调节pH
调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋 白质的有效方法。
影响离子型絮凝剂的电离度。
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六 预处理-加入助滤剂
例硅藻土、淀粉、活性 炭、石英砂、石棉粉、 纤维素、白土等。
对于滤饼阻力较大的物料适应 能力较差。
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带式真空过滤机
• 带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工 艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗 低的一种新型高效的脱水设备。
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带式真空过滤机流程
• 1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连 续进行。 2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤 、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速， 对不同物料有广泛的适应性。
发酵液预处理与固液分离
发酵液的预处理和固液分离方法综述摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。
其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
关键字：预处理固液分离正文：一、发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。
从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。
其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。
并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。
所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。
预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。
大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。
如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。
细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。
如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。
图1－1为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。
图1－1 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。
发酵液预处理
直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液 中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到 结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液， 得到青霉素钾盐。共沸蒸馏结晶： 萃取液，再用0.5 M NaOH萃取， pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加 2.5倍体积丁醇，16－26℃，0.671.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸 物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经 过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。
固液分离
过滤 发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加 少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过 滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。 青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。
（1）菌丝体粗长10µ m，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣 形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋 白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。 （2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0， 加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。 再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。
青霉素发酵液预 处理与固液分离
第三组：宫鹏利 孙晓盼 段玉兰
侯喆 孟佳 赵秀青 苗树峰
发酵液的基本特性
• 产物浓度低
• 具有极性
• 黏大
• 表面张力大
• 性质不稳定
预处理的目的
⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离 固形物的速度，提高固液分离器的效率； ⑵尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数 是液相）； ⑶去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操 作。
加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去 除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。 此外，两者还有协同作用。他们所产 生的复盐对蛋白质有吸附作用。 2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2Zn[Fe(CN)6]2 + 2Na+ 为了有效的去除发酵液中的蛋白质， 需加入絮凝剂。絮凝剂是一种能溶于 水的高分子化合物。含有很多离子化 基团（如—NH2，—COOH，— OH）。
发酵液预处理
1.发酵液预处理过程:对发酵液加热到所需温度使杂蛋白质变性凝固而沉淀分别.也可以用分散或絮凝的方法是小菌体,细胞,细胞的碎片以及杂蛋白质等胶体离子沉降去除.2.发酵液的基本特性:产物浓度低.具有极性.粘度大.表面张力大.性质不稳定.3.预处理的目的:①.转变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分别固形物的速度,提高固液分别器的效率②.尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）③.去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步骤的操作.4.发酵液预处理的方法:①加热②调整PH值③分散和絮凝④使用惰性助滤剂⑤使用反应剂二固液分别1.方法:①重力沉降②浮透（通气产生气泡,使固体附着在气泡表面除去,用于固液比重差小,直径5-30um颗粒的分别,污水处理.③旋液分别（霉菌和放线菌为丝状菌,体形较大,发酵液采纳过滤的方法;细菌和酵母菌为单细胞,体形较小,其发酵液采纳高速离心分别，如对发酵液采纳预处理,也可用过滤进行固液分别.④介质过滤和离心,工业上比较常用.2.过滤①澄清过滤:过滤介质为硅藻土,砂,塑料颗粒等,适合于固体含量少于0.Ig/lOOml,颗粒直径在5-100um的悬浮液的过漉分别如:河水,麦芽汁,酒类,饮料的澄清.②滤饼过滤:过漉介质为滤布,包括自然或合成纤维织布,金属织布,玻璃纤维纸,合成纤维等无纺布,适合于固体含量大于0.lg∕100ml的悬浮液的过滤分别3常用过滤设施①转鼓真空过滤工艺转鼓真空过滤机的转鼓过滤外壁掩盖有金属丝网,网上掩盖有滤布等过滤介质.转鼓内部区域分了若干独立的扇形区,各有不同的操作功能.该设施主要适用范围:颗粒不太细,粘性不太大的液体.对于青霉素发酵老说,发酵液相对粘稠,因此发酵液质量的优劣,对转鼓处理速度有着明确的影响.转鼓过滤存在使用范围窄,处理力量低的问题.•希得艮空过廉根■作示索②板式过滤工艺原理:依靠过滤推动力与过滤介质两侧的压力差,致使固体积累在滤材上并架桥形成滤饼层,使滤液与不溶的杂质分别.板式过滤机的优点是:结构简洁,制造简洁,设施紧凑,过漉面积大而占地面积小,操作压力高,对各种物料适应力量强,缺点是间歇操作,劳动强度大,生产效率低,适用于间歇操作的场合.①装好过漉板框②检查料浆槽的进出口阀门是否关闭③调好料浆④打开料浆槽的进口和排气阀门,启动搅拌机,料浆槽装满料浆后,关闭料浆槽的进口和排气阀门⑤启动空压机待压力达到指定值后,即可打开进气阀进行测定⑥测定完后,清洗设施,关好电源.③其他预处理的工艺近期消失的超滤膜工艺,由于产生的滤液质量好不断被青霉素生产工艺所采纳,但是使用超滤膜会产生大量不宜处理的菌丝水,不宜进行环境处理,同时能耗较高,给生产成本带来较大的压力,在环保压力不断加大的现实状况下,超滤膜工艺被生产企业渐渐放弃,.而传统的板框处理,转鼓过滤工艺,由于受发酵液性质和发酵液影响,存在速度慢等问题,其生产力量受到了肯定的限制,需要改进生产工艺以适应生产的要求,全自动过滤机由于处理效率高,人工劳动强度小被生产企业所用.4 .其他过滤分别方法①切向流水过滤又称错流过滤交叉过滤和十字流过滤,是一种维持恒压下高速过滤的技术,其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流淌,利于流淌的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走.②双水相萃取向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如:葡萄糖,聚乙二醉）后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另一种高分子化合物从而达到分别和提纯某种高分子化合物的目的.③吸附法向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的,主要的目的是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失.5 .预处理及固液分别技术应用实例以链霉菌发酵液的预处理及固液分别技术为例,其工艺过程如下：1-2倍量水稀释发酵液,pH2∙8∙32加热70-75 酸化处理发酵液冷却,过滤, 板框过滤或离心分别 去提取。
发酵液预处理和固液分离
1.2.3 常用的凝聚剂与絮凝剂
➢ 凝聚剂
• 铝盐，铁盐，钙盐，锌盐
➢ 絮凝剂
• 阳离子型：阳离子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯 ，聚二烯丙基四胺盐。
• 阴离子型：聚丙烯酸钠，聚苯乙烯磺酸，木质素磺酸盐 • 非离子型：聚氧乙烯 • 无机高分子类：聚合铝盐，聚合铁盐 • 天然类：壳聚糖，葡聚糖 • 微生物类
➢ 预处理的目的 • 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固 液分离器的效率 • 尽可能使物质转入便于后续处理的某一相中 • 去除发酵液中杂质，利于后续各步操作
➢ 预处理的方法 • 加热-加速聚集，去除某些蛋白质 • 调pH-促进聚集作用 • 凝聚和絮凝-增大颗粒有效尺寸，加快沉降速率
2.3.1 板框压滤机
➢ 自动板框过滤机：
是一种较新型的压滤设备，板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布 的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减 轻了劳动强度。
板框操作实例-进料
板框操作实例-卸料
2.3.2 鼓式真空过滤机
鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较 小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。而对菌体较细或粘稠的发酵 液不太适用。
螺旋式
卧式
• 含固量较多 发酵液的主要 分离方式 • 操作温度可 达300度 • 胰岛素，细 胞色素，胰酶
发酵液的预处理
1 发酵液的预处理
➢主要杂质预处理 ➢凝聚与絮凝
2 发酵液固液分离
➢影响固液分离的因素 ➢过滤 ➢固液分离器
3 全发酵液提取
3 全发酵液提取
扩张床技术
两水相技术
膜技术
• 相当于过滤、浓缩和吸附的综合效果 • 连接的配基容量需求大 • 膜污染问题严重
第三章-发酵液的预处理2-3
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• 凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到 悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子 的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大 体积以便固液分离。
• 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发 酵液的预处理中。
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Filtrate Volume, cm3
pH 2.8
pH 3.8 600
pH 4.2 400 200 pH 4.6
0 0 6 12 18 Time,minutes
The effect on filtrate volume of pH
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4、加入助滤剂（filter aids）
如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀 粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤 效率5倍。
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第二节 发酵液的相对纯化
一、发酵液中的杂质
1、高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+） 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质 的交换容量。
2、杂蛋白 常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞。 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量 和吸附能力。 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化。
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二、预处理目的
⑴改变发酵液固体粒子物理性质，如增大悬浮液 中固体粒子的尺寸，加快固体粒子的沉降速度。
⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无 机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数 是液相）；四环素类抗生素、链霉素。
【3】 发酵液预处理
过滤介质
• 促使滤饼的形成，并成为滤饼的支撑物 • 种类 织物介质 粒状介质 多孔固体介质
• 粒状、多空固体介质 填充型—硅藻土、砂、颗粒活 性炭、玻璃珠、塑料颗粒 成型颗粒滤层—烧结陶瓷、烧 结金属、金属丝 ·适用原料—固体含量 <0.1g/100mL
助滤
一种不可压缩的多孔微粒，使滤 饼疏松，从而增加滤速 硅藻土 活性炭 石棉 锯屑
——加热、变性试剂、表面活性剂、有机 溶剂、絮凝剂 依据机理： （1）水溶性蛋白质溶液是胶体体系 （2）蛋白质所带电荷因溶液pH改变而改变 （3）蛋白质溶液缓冲能力很强 （4）蛋白质具有热敏性
固液分离
• • • •
离心分离 过滤 双水相萃取 吸附
离心分离
借助离心机旋转所产生的离心力，根 据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及 浮力等因子的不同，使物质进行分离 要根据欲分离物质、杂质的大小、密 度、特性等不同，选择适当离心机、离 心方法和离心条件
• 过滤介质—滤布 • 适用原料—固体含量>0.1g/100mL
• 过滤操作 过滤阶段 恒速过滤—初期 恒压过滤—后期 滤饼洗涤 滤饼干燥 滤饼卸除
板框压滤机
应用
• 液体的澄清 • 分离难以过滤的低浓度悬浮液或胶体悬浮液 • 分离液相粘度大或接近饱和状态的悬浮液
真空转鼓压滤机
• 配合硅藻土，适用于 霉菌发酵液的过滤
凝聚与絮凝
• 凝聚：指在电解质的作用下，由于胶粒之间 的双电层电排斥作用降低，电位下降，而使 胶体体系不稳定的现象
• 絮凝：指在某些高分子絮凝剂的存在下，基 于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程
凝聚
Al2(SO4)3·18H2O AlCl3·6H2O FeCl3·6H2O FeSO4·7H2O CaCO3 ZnSO4 MgCO3
3 发酵液的预处理和菌体的回收
路线一A
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳) 层析、电泳 ) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩(超过滤) 浓缩( 超过滤) 精制( 结晶、干燥) 结晶、干燥 )
从培养液中回收菌体是固-液分离的 难题，实际可行的回收方法不多，理想 的效果是回收方法廉价、简便和可靠， 但实际上不大可能达到。因为大多数细 胞回收操作受到技术和经济的限制，所 以回收操作成为生物技术下游加工过程 的瓶颈问题。
⑥动植物细胞没有微生物细胞耐剪切，不适于离心。
因此，这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难。
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工业技术中典型的固体粒子
固体粒子的类型 细胞碎片 尺寸（mm× mm) <0.4 × 0.4
细菌细胞
酵母细胞 哺乳动物细胞 植物细胞 真菌菌丝或丝状细 菌 絮凝物
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3 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细 胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散 状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提 高过滤速率。除此之外，还能有效地除 去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。 因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用 的预处理方法之一。常用于菌体细小而 且粘度大的发酵液的预处理。
过滤介质: 1、无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤; 2、成形颗粒：烧结金属、烧结塑料; 3、非金属织物：尼龙、玻璃纤维; 4、金属织物：不锈钢丝网; 5、无纺品：纸、石棉
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3.4.1 过滤的理论基础
达西定律 （Darcy’s Law） 反映水在岩土孔隙中
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4 助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能吸附胶 体，使滤饼疏松，扩大过滤面积，滤速增大。 原因是充当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体 的能力、并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型 结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良 好的渗透性，既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截 留在格子骨架上，又能使清液有流畅的沟通。所以使 用惰性助滤剂能大大提高过滤能力和生产效率、改善 滤液澄清度，降低过滤成本。
发酵液预处理方法
03
综合应用
结合凝聚和絮凝技术，提高过滤效果 。先使用凝聚剂使胶体颗粒变大，再 加入絮凝剂形成絮凝团，便于固液分 离。
综合使用多种方法
根据实际情况选择合适的方法
01
考虑发酵液特性、过滤要求及设备条件，例如对于含大量固体
颗粒的发酵液，先离心再过滤。
优化过滤工艺参数
02
调节转速、温度、压力等参数及助滤剂种类和用量，提升过滤
凝聚和絮凝技术
01
凝聚技术
定义：在中性盐作用下，胶体体系因 双电层排斥电位降低而变得不稳定的 现象。过程：加入电解质后，胶体粒 子间排斥作用减弱，导致电位下降， 胶体体系脱稳，粒子相互碰撞形成 1mm大小的凝聚体。
02
絮凝技术
定义：在高分子絮凝剂存在下，胶粒 形成粗大絮凝团的过程，主要基于物 理集合。絮凝剂特性：溶于水的高分 子聚合物，长链状结构，链节含活性 官能团，能强烈吸附在胶粒表面。
效果。
定期维护和保养过滤设备
03
定期检查、清洗设备，校准传感器和控制系统，确保设备正常
运行。
04
预处理和固液分离
胞内产物的预处理
降低液体黏度
通过加热或加水稀释发酵液来降 低其黏度，从而改善过滤特性。 加热法虽然有效，但可能影响产 物的活性和细胞自溶；加水法则 会增加发酵液体积和降低目标产 物浓度。
度减慢。
滤饼堵塞
随着过滤的进行，滤饼会逐渐增厚 ，导致过滤阻力增大，最终使过滤 操作无法继续进行。
目标产物损失
在过滤过程中，由于滤饼的堵塞和 吸附作用，容易导致目标产物的损 失，影响产品的质量和产量。
过滤工艺优化的重要性
提高过滤速度
延长过滤介质的使用寿命
通过优化过滤工艺，可以有效地提高 过滤速度，减少过滤时间，提高生产 效率。
发酵液预处理和固液分离
当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间范德华引力 时，由于热运动的结果，导致胶粒的相互碰撞而 聚集。
由此可见，在发酵液中加入具有高价阳离子的电 解质，由于ξ电位的降低和脱除胶粒表面水化膜， 就导致了胶粒间的凝聚作用。
电解质的凝聚能力用凝聚价或凝聚值来表示
凝聚价或凝聚值： 使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度
不同界面上形成不同 的电位:
胶核表面的电位φs 是整个双电层的电位;
Stern平面上的电位 为φd;
滑移面上的电位为ζ, 称ζ电位。
ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征 双电层的特征。
带电粒子间的静电相互作用取决于ζ电位的大小。 当双电层的ζ电位足够大时，静电排斥作用抵御分
子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。
子直径约1-30nm，呈胶体性质; 蛋白质水化层：蛋白质分子周围存在与蛋白质
分子紧密或疏松结合的水化层。紧密结合的水 化层可达到0.35g/g蛋白质，而疏松结合的水化 层可达蛋白质分子质量的2倍以上； 静电排斥作用：
(1)胶体双电层结构
➢发酵液中菌体表面带 有负电荷，由于静电 引力使溶液中反离子 被吸附在其周围。 ➢正离子同时受到使它 们均匀分布的热运动 影响，具有离开胶粒 表面的趋势，在界面 上形成了双电层。
2）高分子絮凝剂的吸附架桥作用
3）对絮凝剂的化学结构的要求
1）其分子必须含有相当多的活性官能团，使之 能和胶粒表面相结合。
2）要求必须具有长链的线性结构，以便同时与 多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子量 不能超过一定限度，以使其有良好的溶解性。
4）工业上使用的絮凝剂
可分为四类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机 高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂
发酵液预处理
第三章发酵液预处理从微生物发液中提取发酵产品的第一步骤就是预处理，其目的的不仅在于分离菌体和其他悬浮液的性质，以利用于提取和精制后断各工序的顺利进行。
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。
大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都有含有。
–对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；–对于胞内产物，则首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。
第一节发酵液过滤特性改变微生物发酵液的特性可归纳为：发酵产物浓度较低，大多为1%～10%，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大：固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
一、降低液体粘度降低液体粘度的常用方法有加水稀释法和加热法等。
采用加水稀释虽然降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。
若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。
升高温度可有效降低液体粘度，提高过滤速率，如12ºBe 麦芽汁40℃时粘度为1.2×10-3Pa·s，升高到75℃其粘度可下降一半，过滤速率可加倍。
同时，在适当温度和受热时间可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。
如链霉素发酵液，调酸至pH3.0后。
加热至70℃，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可增大10~100倍。
使用加热时必须严格控制加热温度与时间。
二、调整pH⏹pH值直接影响发酵液中某些物质有电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。
⏹对于氨基酸、蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下，净电荷为零，称为等电点下，两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法提取谷氨酸。
发酵液预处理
倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续 排渣。具有操作连续、适应性强、应用范围广、结 构紧凑和维修方便等特点。但不适应于细菌酵母菌 等微小生物悬浮液的分离，此外，液相澄清度也相 对较差。
4.2 过滤分离法
• 过滤是传统的优化单元操作，其原理是悬 浮液通过过滤介质时，固体颗粒与溶液分 离。根据过滤机理的不同，过滤法可分为 澄清过滤和滤饼过滤两种。
离心法分类
离心沉降：利用固液两相的相对密度差，在离心机无 孔转鼓或管子中进行悬浮液的分离操作。
离心过滤：利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓 离心机中分离悬浮液的操作。
离心分离和超离心：利用不同溶质颗粒在液体中各部 分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。
离心机种类
碟片式离心机
管式离心机
倾析式离心机
在相距胶核表面约一个离子半径的Stern平面 以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附 层或紧密层； 在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩 散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶 液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散 双电层的结构模型，
如图所示：
这三种电位中只有 ζ 电位能实际测得，所以可以 认为是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征 双电层的特征。 ζ ＝4π qδ /D D—水的介电常数； q —胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷 密度； δ —扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层 界面处电位φ d降低到其值为1/e处的距离。
絮凝机理： 胶体理论 双电层理论 高聚物架桥理论
絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其 相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构， 其链节上含有许多活性官能团， 包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及不带电荷 的非离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物 的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生 桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝 作用。
发酵液的预处理讲解
这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
影响絮凝效果的因素：
1) 絮凝剂浓度（用量） 2) 絮凝剂分子量 3) 絮凝剂类型 4) 溶液的pH 5) 搅拌速度和时间 6) 助凝剂
Ga2+：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷 酸盐，生成磷酸钙
Mg2+：加入草酸（沉淀不完全）；加入磷酸盐， 生成磷酸镁；三聚磷酸钠（Na5P3O10），生成可 溶性络合物
Fe3+：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀
二、 发酵液的过滤
发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的 固体培养基成分，过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒 与液体进行分离的过程。 定义：
它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别 吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团， 这就是絮凝作用。
絮凝剂
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴 离子型(含有羧基)和阳离子型(含有胺基)三类。
A. 聚丙烯酰胺类衍生物 B. 聚苯乙烯类衍生物 C. 无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。 D. 天然有机高分子絮凝剂：多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，
在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中 的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。
1.过滤介质
使滤液通过，截留固体颗粒并支撑滤饼的材料。 要求其具有多孔性、耐腐蚀性及足够的机械强度。
工业常用的过滤介质：织物介质、多孔性固体、 粒状介质。 无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等
成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘 结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。
第三章 发酵液预处理
（3）吸附法 如在四环类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌 生成亚铁氰化锌钾 k2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉 淀来吸附蛋白质。
第 三 章
发 酵 液 预 处 理
第三节 固液分离工程及设备
第 三 章
发 酵 液 预 处 理
第一节 发酵液过滤特性的改变
④液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 第 ⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧 三 章 化、微生物污染、蛋白质酶水解等作用的影 响。
发 酵 以上使固液分离变得相当困难，应进行适当 液 预 预处理才行，降低滤饼比阻，提高过滤与分 处 离速度。 理
第一节 发酵液过滤特性的改变
（2）含有不溶性多糖物质的发酵液中，加 入酶水解成单糖→过滤速率上升，如万古霉 用淀粉作培养基，发酵过滤前加入0.025% 的淀粉酶，搅30min，再加2.5%硅藻土助滤 剂→速率提高5倍。
第 三 章
发 酵 液 预 处 理
第二节 发酵液的相对纯化
第二节 发酵液的相对纯化 一、高价无机离子的除去 1、高价无机离子的影响 在采取离子交换法时，这些高价无机离 子会影响树脂对生化物质的变换容量。 发酵液中的主要无机离子有Ca2+ 、Mg2+和 Fe2+等。
3、混凝 混凝是包括凝聚和絮凝机理的过程。 （1）单独使用絮凝剂 如带负电的菌体、蛋白质+阳离子型高分子 絮凝剂→具有降低胶粒双电层电位，产生吸 附桥架的双重作用。
第 三 章
பைடு நூலகம்
发 酵 液 预 处 理
第一节 发酵液过滤特性的改变
（2）电解质+絮凝剂 在无机电解质的凝聚作用基础上，高分子絮 凝剂架桥絮凝→效果更好
发酵液预处理
2.3 发酵液杂质的去除
在预处理时，应尽量除去高价无机离子、杂蛋白等。 2.3.1无机离子的去除 （1）钙离子的去除 在发酵液中加入草酸。作用：1 除去钙离子；2 去除部分镁离子; 3 同时草酸可酸化发酵液，使发酵液的胶体状态改变，有助于目 标产物转入液相。由于草酸的溶解度较小，用量大时可用其可溶 性盐(如草酸钠)。4 反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提 高滤液质量。 缺点：草酸的价格较高，如果回收利用可以降低成本。例如：在 四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60℃下反应生成草酸铅，草 酸铅在90～95℃下用硫酸分解，再经过滤、冷却、结晶操作后即 可回收草酸。
2.5.5絮凝的优化
选择使用何种絮凝剂要综合考虑成本、可行性、 毒性等多方面因素。此外，絮凝效果与絮凝剂 的加入量、分子量和类型，溶液的pH、搅拌 速率和时间等因素有关。 加入助凝剂可以增加絮凝效果。 剪切力及处理时间(添加絮凝与进一步分离之 间的间隔时间)也是很重要的优化参数。
絮凝的优化流程为：①准备好所需的絮凝剂及化学试 剂；②分别向烧杯中倒入500～1000mL的悬浮液试样； ③搅拌(桨叶速率可为200r／min)；④通过加酸或加碱 调节每个试样的pH值(例如，如果有6个试样，则分别 使其pH值为4、5、6、7、8和9)；⑤同时向各烧杯中 加入助凝剂，并开始计时；⑥继续保持高搅拌速率 5min；⑦加入絮凝溶液，于1min内混合均匀；⑧降低 搅拌速率(例如降至50r／min)保持15min；⑨分析絮凝 结果(可通过静置或过滤等方法)
第三章发酵液预处理介绍
第三章发酵液预处理介绍第一节发酵液预处理的意义发酵液预处理是指在微生物发酵过程中对发酵液进行一系列阶段性加工处理的过程，其目的是为了提高发酵液的品质和产量，并为后续的纯化和提取工艺提供更好的条件。
发酵液中包含有各种生物活性物质，如细胞酶、蛋白质、多糖、有机酸等，这些物质的存在对发酵液的利用和后续处理造成了一定的困难。
因此，在发酵过程中，通过一系列预处理措施的引入，能够有效地提高发酵液的品质，使得后续的纯化、分离和提取工艺更加顺利进行。
第二节发酵液预处理的主要方法1.发酵液的过滤在发酵过程中，微生物会产生大量的菌体、代谢产物等物质，通过过滤可以将这些悬浮在发酵液中的物质进行分离。
过滤可以采用不同的方法，如微孔滤膜、滤布、滤纸等，根据发酵液中悬浮物质的大小和特性选择合适的过滤方式。
2.发酵液的沉淀通过沉淀可以将发酵液中的颗粒物质和胶状物质分离出来，常用的沉淀剂包括铝盐、聚合物等。
沉淀剂的选择需要根据发酵液的特性来确定，同时需要考虑沉淀剂的剂量和沉淀时间等因素。
3.发酵液的调节发酵过程中可能会出现pH值过高或过低的情况，需要进行调节。
通常采用的方法是加入酸碱，将发酵液的pH值调节到适宜的范围内。
同时，还可以通过添加营养物质，如氮源、磷源等，来调节发酵液中的营养成分。
4.发酵液的浓缩发酵液中的微生物和代谢产物通常是以溶液的形式存在，为了将其纯化和提取，需要将发酵液进行浓缩。
常用的方法包括真空浓缩、膜浓缩等，根据发酵液的性质选择合适的浓缩方式。
第三节发酵液预处理的应用案例1.青霉素的生产青霉素是一种重要的抗生素，用于治疗各种感染病症。
青霉素的生产过程中，需要对发酵液进行一系列的预处理。
首先，通过过滤将发酵液中的微生物和悬浮颗粒物进行分离。
然后，采用酸碱调节的方法，将发酵液的pH值调节到适宜的范围。
最后，通过真空浓缩将发酵液中的青霉素进行提取和纯化。
2.乳酸的生产乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
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5. 加入反应剂：
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如 CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块 状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固， 改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化 为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液 过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助 滤剂，可提高过滤效率5倍。
团，这就是絮凝作用。
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工业上使用的絮凝剂可分为三类： 1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、 聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海 藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③固体粒子可压缩性大； ④液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生
物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。
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（二）改善发酵液过滤特性的物理化学方法
通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体 性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂 质对过滤的影响，提高过滤速率。
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（三）凝聚与絮凝
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶 体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤， 常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。
通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的 作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周 围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们 均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势， 在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分。
分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构， 其链节上含有许多活性官能 团， 包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及 不带电荷的非离子型基团。
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它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作
用，强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同
的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮
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在相距胶核表面约一个离子半径的Stern平面以内， 正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层；
在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开 去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓 度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型， 如图所示。
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扩散双电层的结构模型图
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电位φd降低到其值为1/e处的距离，
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ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散 层厚度又与溶液中离子强度有关，当双电层的排斥力不足 以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶 粒的互相碰撞而聚集起来。
在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能降低ζ电 位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。
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4. 加入助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏 松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到 助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。
常用的助滤剂 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。
最常用的是硅藻土，使用时，通常细粒用量为500 g/m3； 中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。
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1、凝 聚
凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排
斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳 定的现象。 凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。
反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。
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阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+ 常用的凝聚剂电解质有：
当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体随 着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移 面（剪切面）在图14－l中用波为是 控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征。
ζ＝4πqδ/D D—水的介电常数； q—胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度； δ—扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
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2、絮 凝
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用， 使胶粒形成较大絮凝团的过程。
絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对
1. 降低液体粘度： 根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的
粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。注意加 热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
有加水稀释法和加热法
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2. 调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷 性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。
氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发 酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值 改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；
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方法选择
对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物 转移到液相，然后经固液分离除去固相；
对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞， 经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞
碎片分离。
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一 、发酵液过滤特性的改变
（一）微生物发酵液的特性
①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液 中大部分是水；
第三章 发酵液预处理
一 、发酵液过滤特性的改变 二、 发酵液的相对纯化 三、 固液分离工程及设备
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发酵液成分
微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生 物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各 种代谢产物。
目的
分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和 改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利 进行。
细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下 也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
主要有等电点沉淀法
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3. 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎 片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较 大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除 去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。