发酵学第2章工业微生物菌种选育
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发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
发酵工业菌种选育 酿酒主要微生物
黑根霉
菌落生长初期为自色，后期为灰褐色 至黑褐色。此菌能产生果胶酶，常引起 水果的腐烂和甘薯的软腐。其最适生长 温度为30℃ ,37℃时不能生长。
毛霉
总状毛霉
总状毛霉是毛霉中分布最广 的一种。菌丝灰白色，菌丝 直立而稍短，孢子囊柄总状 分枝，孢子囊球形，浅黄色 至黄褐色。在豆腐坯和熟大 豆上生长迅速，我国四川的 豆豉即用此菌制成。
02 01
鲁氏毛霉
此菌种最初是从我国小曲中分离出来 的，菌落在马铃薯培养基上呈黄色，在 米饭上略带红色，袍子囊柄呈假轴状分 枝，厚垣孢子数量很多，大小不一，黄 色至褐色。鲁氏毛霉能产生蛋白酶，有 分解大豆的能力，我国多用它来做豆腐 乳。
活性干酵母
鲜酵母经过低温脱水后 制得水分7.0～8.5%酵 母为活性干酵母
卡尔酵母
卡尔酵母是啤酒酿造中典型的下面酵母，又称卡尔斯伯酵母。常用于啤酒酿造。能发 酵葡萄、半乳糖、Байду номын сангаас糖、麦芽糖及全部棉子糖。
球拟酵母
具有酒精发酵力
在工业上利用糖蜜生产 甘油
球拟酵母能使葡萄糖转化为多元醇
耐高渗透压
在酱油和酱的发酵中产 生香气的重要菌种
红曲霉
红曲霉在培养基上生长时，菌丝体初为白色，以后变成淡粉色、紫红色或黑灰色等，
通常都能形成红色素，可作为食品加工中天然红色色素的来源。如在红腐乳、饮 料、肉类加工中用的红曲米，就是用红曲霉制作的。
米根霉
这个种在我国酒药和酒曲中常看到， 在土壤、空气，以及其他各种物质中亦 常见。菌落初期为白色，后期为灰褐色 至黑褐色。此菌有糖化淀粉、转化蔗糖 的能力。
毕赤酵母
是酿造的有害菌，经常在酱醪或醋醅表面形成黏稠皮膜，并产生不愉快的气味，影响 发酵的正常进行，还能在酱油表面形成白花，消耗酱油中的糖分、氨基酸等，形成难闻的 气味，破坏酱油的品质。
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌
诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
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(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
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连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
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比生长速率u
A B
r
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基质浓度
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限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
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2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
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3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
第二节 工业微生物菌种选育
1.选择出发菌株
• 出发菌株是指用于诱变的原始菌种。 • 选择原则：菌种对诱变剂的敏感性强、变 异幅度大、产量高。 • 获得途径： （1）从自然界的土样或水样中分离出来的野 生型菌种； （2）生产中正在使用的菌种； （3）从菌种保藏机构购买
2.同步培养
• 培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们 的生理状态和代谢活动也不完全一样。 • 同步培养法：使培养的微生物比较一致， 生长发育在同一阶段上的培养方法。 • 在诱变育种前，最好选用生理状态一致的 单细胞或单孢界直接分离筛选菌种的步骤
• 1.采样： （1）选择采样地点 中性偏碱：细菌和放线菌多 酸性红土壤及森林土壤：霉菌多 果园、菜园、野果生长区（富含碳水化合物）和沼泽池：酵母和霉 菌多。 （2）确定采样时间 秋初好：温度适中，雨量不多。 夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后显著减少。 （3）采样 5cm~15cm处取土。放在牛皮纸袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，标明 样品种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等 采集的样品应及时处理，暂不处理应放在4℃保存。
机械法 （选择法） 离心沉降分离法
同步培养方法 诱导法 温度调整法
膜洗脱法
营养条件调整法
特点：同步生长只能维持几代
机械法
膜洗脱法
通过大小不同 的微孔过滤器
离心沉降分离法
小细胞 沉淀慢
• 主要通过控制环境条件：如温度、营养物质等来诱导同步生 长。 • （1）温度调整法 • 将温度控制在接近最适温度条件下一段时间，缓慢进行新陈 代谢，但不进行分裂。然后再将温度提高到最适生长温度， 大多数细胞进行同步分裂。 • （2）营养条件调整法 • 控制培养基的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限 制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续 生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基 中，它们便进入了同步生长。 • 另外有在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质（如氯霉 素）诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用 紫外线处理；对光合行微生物的菌体可采用光照与黑暗交替 处理法等。 • 总之：不管采用哪种诱导因子，都必须具有以下特性：不影 响生物的生长，但可特异性地抑制细胞分裂，当移去（或消 除）该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。
工业发酵菌种选育
进一步应用选择性控制条件分离
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
发酵工程第2章_菌种选育
• 脂肪酶产生菌的分离
• 为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色 圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作 为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性 的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。
• 乙醇产生菌的分离
• 通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙 醇的菌株。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
37
五、自然界中细菌的分离
（三）分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 淀粉酶产生菌的分离：
• 分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为 惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过 培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来 区别产酶菌株。
• 碘可以杀菌，一旦染色就很容易把细菌杀死，而曲利 苯蓝只是对细菌有影响但不会杀死。，建议选用0.0050.01%含量。
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养
箱中存放3天。
• 在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层 含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和 NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的 电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡 白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。
发酵工业菌种选育 微生物代谢类型
初级代谢产物和次级代谢产物的关系
3.存在范围不同
初级代谢：代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同
普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型 次级代谢：只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物
不同而不同
4.对微生物的作用不同
初级代谢:初级代谢产物通常是机体生存必不可少的物质 次级代谢：次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能
初级代谢产物和次级代谢产物的关系
1.概念不同 初级代谢：在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种 营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和 能量的过程 次级代谢：是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前 体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程
2.产物不同 初级代谢→初级代谢产物 次级代谢→次级代谢产物
7.相关酶的专一性不同
初级代谢:催化初级代谢产物合成的酶专一性强 次级代谢：催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强
8.两者既有区别性又有 连续性
初级代谢是次级代谢的基础 次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展
初级代谢产物和次级代谢产物的关系
2. 工业发酵菌种的选育
2.1.1微生物代谢产物的类型
初级代谢产物
初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖 所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
次级代谢产物
次级代谢产物
02
次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的 一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免 在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不 利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类 型，次级代谢产物通常是在生长后期合成。
5.同微生物生长过程的 关系
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4、从突变到突变型
表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变 分离型迟延 (基因杂合)
经诱变处理后，细胞中的基因处于 不纯的状态，突变型基因由于属于隐 性基因而暂时得不到表达，需经过复 制、分离，在细胞中处于纯的状态时， 其性状才得以表达。
生理性迟延
新的表型必须等到原有基因的产物 稀释到某一程度后才能表现出来。
第一节 概述 第二节 自然选育 第三节 诱变育种 第四节 杂交育种
第一节 概述
一、工业微生物 二、发酵工业对菌种的要求 三、菌种选育的目的 四、菌种选育的基本理论 五、菌种来源
第一节 概述
一、工业微生物 1.细菌
2.放线菌（单细胞原核微生物）
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
(CGMCC)
中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM——管理机构
订购程序
申请 生物安全性说明 确认 订货
第二节 自然选育
一、定义 二、方法 三、特点及应用
第二节 自然选育
一、定义
自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，
根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。
自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下
第三节 诱 变 育 种
三、诱变育种的主要环节
1.出发菌株的选择 2.诱变处理 举例 3.筛选 4.突变菌株高产基因的表达
1.出发菌株的选择
选择纯种菌株（排除异核体） 优良性状的菌株（产生孢子、生长速度） 对诱变剂敏感的菌株 同时选择几株不同的优良菌株
2.诱变处理
1）诱变剂的选择
2、菌种遗传特性的改变
1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生同
菌种遗传特性发生改变
2）自发突变
3）回复突变或产生分离子--形成具有不同基因型的 个体
回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回 复突变。
3、菌种生理状态的改变 主要是因为培养条件不适当。
第一节 概述
四、菌种来源
从菌种保藏中心购买 育种
从自然界中筛选 诱变 杂交育种 基因工程育种
source 1
国际承认的中国培养物保藏单位
武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 CCTCC。保藏了几乎所有的培 养物。
中科院微生物研究所的 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC。保藏 有普通菌种。
第一节 概述
二、发酵工业对菌种的要求
1.生产力：
能在廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的产量高，其它代谢产 物少
2.操作性：
发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途 径尽可能地简单），产品易分离
3.稳定性：
抗杂菌和抗噬菌体能力强，遗传性状稳定，菌种不易变异退化
1）一个菌种不是纯一的群体。
2）培养基营养成分的影响
3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同， 使得菌种的生理状态不同。
第三节 诱 变 育 种
一、定义及特点 二、诱变剂 三、诱变育种的主要环节
第三节 诱 变 育 种
一、定义及特点
诱变育种：
通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度， 然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良 特性的变异菌株的方法。
4.安全性：
是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
第一节 概述
三、菌种选育的目的
1、提高发酵产量 2、改进菌种的性能 3、产生新的发酵产物 4、去除多余的组分
第一节 概述
四、菌种选育的基本理论
（一）菌种选育的理论基础 （二）突变诱发的过程
（一）菌种选育的理论基础
遗传和变异
特点：
速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。
第三节 诱 变 育 种
二、诱变剂
紫外线 快中子
物理诱变剂
NTG 亚硝酸 烷化剂
化学诱变剂
噬菌体 转座子
生物诱变剂
烷化剂是重要的诱变剂，带有活性烷基，通过烷化磷酸基、 碱基与DNA作用。
第三节 诱 变 育 种
突变的诱发 ↓
突变株的筛选 ↓
突变高产基因的表现
（二）突变诱发的过程
（二）突变诱发的过程
（二）突变诱发的过程
SOS修复系统 它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。
其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。
（二）突变诱发的过程
3、从前突变到突变 校正差错：光复活作用、切补修复 引起差错：重组修复、SOS修复系统。
（二）突变诱发的过程
生产多种抗生素
抗生素中60%以上由放线 菌产生，如链霉素、红霉 素、金霉素、庆大霉素等。
3.酵母菌
酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为 圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、 藕节状、腊肠形，假菌丝等 。
4.藻类
许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将 CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。
基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产 生的遗传性状的变异。
（二）突变诱发的过程
1、前突变形成
前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改
变称为前突变。
影响前突变产
细胞对诱变剂的透性
生的的因素
细胞质和酶的影响
基因所处的状态
（二）突变诱发的过程
2、DNA损伤的修复
1）光复活作用 2）切补修复 3）重组修复 4）SOS修复系统（多数诱变来源于此） 5）DNA多聚酶的校正作用
所发生的那些突变。
多因素低剂量的诱变效应 互变异构效应
第二节 自然选育
二、菌种自然选育方法
单菌落分离法 菌种 单细胞悬液 琼脂板分离 挑取单菌落
测定生产能力
细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养 放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角 瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。
用刚果红染色法鉴定筛选降 解纤维素的菌株
抗生素筛选
羧甲基纤维素钠作培养物 检定菌培养，加上发酵液
第二节 自然选育
三、特点及应用
简单易行、自发突变的效率低。 纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产
量
菌种衰退原因的分析
1、目前生产用菌种的特点
多为人工诱变而来。 代谢调控系统失控。 生活力比野生菌株弱。 容易发生变异。
表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变 分离型迟延 (基因杂合)
经诱变处理后，细胞中的基因处于 不纯的状态，突变型基因由于属于隐 性基因而暂时得不到表达，需经过复 制、分离，在细胞中处于纯的状态时， 其性状才得以表达。
生理性迟延
新的表型必须等到原有基因的产物 稀释到某一程度后才能表现出来。
第一节 概述 第二节 自然选育 第三节 诱变育种 第四节 杂交育种
第一节 概述
一、工业微生物 二、发酵工业对菌种的要求 三、菌种选育的目的 四、菌种选育的基本理论 五、菌种来源
第一节 概述
一、工业微生物 1.细菌
2.放线菌（单细胞原核微生物）
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
(CGMCC)
中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM——管理机构
订购程序
申请 生物安全性说明 确认 订货
第二节 自然选育
一、定义 二、方法 三、特点及应用
第二节 自然选育
一、定义
自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，
根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。
自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下
第三节 诱 变 育 种
三、诱变育种的主要环节
1.出发菌株的选择 2.诱变处理 举例 3.筛选 4.突变菌株高产基因的表达
1.出发菌株的选择
选择纯种菌株（排除异核体） 优良性状的菌株（产生孢子、生长速度） 对诱变剂敏感的菌株 同时选择几株不同的优良菌株
2.诱变处理
1）诱变剂的选择
2、菌种遗传特性的改变
1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生同
菌种遗传特性发生改变
2）自发突变
3）回复突变或产生分离子--形成具有不同基因型的 个体
回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回 复突变。
3、菌种生理状态的改变 主要是因为培养条件不适当。
第一节 概述
四、菌种来源
从菌种保藏中心购买 育种
从自然界中筛选 诱变 杂交育种 基因工程育种
source 1
国际承认的中国培养物保藏单位
武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 CCTCC。保藏了几乎所有的培 养物。
中科院微生物研究所的 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC。保藏 有普通菌种。
第一节 概述
二、发酵工业对菌种的要求
1.生产力：
能在廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的产量高，其它代谢产 物少
2.操作性：
发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途 径尽可能地简单），产品易分离
3.稳定性：
抗杂菌和抗噬菌体能力强，遗传性状稳定，菌种不易变异退化
1）一个菌种不是纯一的群体。
2）培养基营养成分的影响
3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同， 使得菌种的生理状态不同。
第三节 诱 变 育 种
一、定义及特点 二、诱变剂 三、诱变育种的主要环节
第三节 诱 变 育 种
一、定义及特点
诱变育种：
通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度， 然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良 特性的变异菌株的方法。
4.安全性：
是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
第一节 概述
三、菌种选育的目的
1、提高发酵产量 2、改进菌种的性能 3、产生新的发酵产物 4、去除多余的组分
第一节 概述
四、菌种选育的基本理论
（一）菌种选育的理论基础 （二）突变诱发的过程
（一）菌种选育的理论基础
遗传和变异
特点：
速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。
第三节 诱 变 育 种
二、诱变剂
紫外线 快中子
物理诱变剂
NTG 亚硝酸 烷化剂
化学诱变剂
噬菌体 转座子
生物诱变剂
烷化剂是重要的诱变剂，带有活性烷基，通过烷化磷酸基、 碱基与DNA作用。
第三节 诱 变 育 种
突变的诱发 ↓
突变株的筛选 ↓
突变高产基因的表现
（二）突变诱发的过程
（二）突变诱发的过程
（二）突变诱发的过程
SOS修复系统 它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。
其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。
（二）突变诱发的过程
3、从前突变到突变 校正差错：光复活作用、切补修复 引起差错：重组修复、SOS修复系统。
（二）突变诱发的过程
生产多种抗生素
抗生素中60%以上由放线 菌产生，如链霉素、红霉 素、金霉素、庆大霉素等。
3.酵母菌
酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为 圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、 藕节状、腊肠形，假菌丝等 。
4.藻类
许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将 CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。
基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产 生的遗传性状的变异。
（二）突变诱发的过程
1、前突变形成
前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改
变称为前突变。
影响前突变产
细胞对诱变剂的透性
生的的因素
细胞质和酶的影响
基因所处的状态
（二）突变诱发的过程
2、DNA损伤的修复
1）光复活作用 2）切补修复 3）重组修复 4）SOS修复系统（多数诱变来源于此） 5）DNA多聚酶的校正作用
所发生的那些突变。
多因素低剂量的诱变效应 互变异构效应
第二节 自然选育
二、菌种自然选育方法
单菌落分离法 菌种 单细胞悬液 琼脂板分离 挑取单菌落
测定生产能力
细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养 放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角 瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。
用刚果红染色法鉴定筛选降 解纤维素的菌株
抗生素筛选
羧甲基纤维素钠作培养物 检定菌培养，加上发酵液
第二节 自然选育
三、特点及应用
简单易行、自发突变的效率低。 纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产
量
菌种衰退原因的分析
1、目前生产用菌种的特点
多为人工诱变而来。 代谢调控系统失控。 生活力比野生菌株弱。 容易发生变异。