常用的单克隆抗体检测方法
高效液相色谱-荧光检测器法检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量
Vol.7 No.1Feb. 2021生物化工Biological Chemical Engineering第 7 卷 第 1 期2021 年 2 月高效液相色谱-荧光检测器法检测单克隆抗体注射液中吐温80的含量张博慧，贾戴辉，许俊彦*（宝船生物医药科技（上海）有限公司药物分析部门，上海 201203）摘 要：目的：采用高效液相色谱-荧光检测器法（HPLC-FLD）测定单克隆抗体注射液中吐温80的含量，并进行方法学验证。
方法：按设定的色谱条件对检测单克隆抗体注射液中吐温80含量的HPLC-FLD 法进行方法学验证，包括专属性、精密度、准确度、线性和范围、耐用性，并采用该方法对不同单克隆抗体注射液进行检测。
结果：经验证，该方法具有专属性；重复性验证试验中，保留时间和含量的RSD 值分别为0.5%和0.4%；中间精密度验证试验中，保留时间和含量的RSD 值分别为0.4%和2.2%；准确度验证试验中，回收率分别为105%、98%和108%；线性相关系数为0.999 1，检测范围为0.05~0.80 mg/mL；不同批次反应线圈对检测结果无影响，不同品种单克隆抗体注射液吐温80含量检测结果偏差较小。
结论：该方法具有专属性，线性关系良好，精密度和准确度较好，测定结果稳定可靠，适用于单克隆抗体注射液中吐温80含量的检测。
关键词：高效液相色谱-荧光检测器；吐温80；单克隆抗体注射液中图分类号：R927.2 文献标识码：ADetermination of Tween80 Content in Monoclonal Antibody Injection by HPLC-FLDZHANG Bohui, JIA Daihui, XU Junyan *(Drug Analysis Department, Dragonboat Biopharmaceutical, Co., Ltd, Shanghai 201203)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Tween 80 in monoclonal antibody injection byHigh-performance liquid chromatography fluorescence detector. Methods: Under designed condition, the method was verified for specificity, precision, accuracy, linearity, range and durability. The method was also used to determination of Tween 80 content of different monoclonal antibody injections. Results: The HPLC-FLD method showed good specificity. In reproducibility test, the RSD of retention time and content were 0.5% and 0.4% respectively. In intermediate-precision test, the RSD of retention time and content were 0.4% and 2.2% respectively. The recovery rates were 105%, 98% and 108% respectively. The correlation Coefficient was 0.999 1 and the range was from 0.05 to 0.8 mg/mL. The different batches of reaction coils had no effect on the detection results. The Tween 80 contents in different mAb injections showed little deviation. Conclusion: The HPLC-FLD method showed good specificity, precision, accuracy and linearity, and the test result was stable and reliable, which was suitable for determination of Tween 80 content of different monoclonal antibody injections.Keywords: High-performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector; Tween 80; monoclonal antibody injection吐温80又名聚山梨酯80，其化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，作为助溶剂、乳化剂和稳定剂，常用于治疗性单克隆抗体注射液制剂中[1]。
96孔板筛选单克隆细胞原理
96孔板筛选单克隆细胞原理单克隆抗体技术是现代生物技术领域的重要分支，而96孔板筛选单克隆细胞是其核心技术之一。
本篇文档将详细介绍96孔板筛选单克隆细胞的原理，包括细胞筛选原理、孔板特点、细胞培养环境、筛选方法以及检测设备等方面。
一、细胞筛选原理单克隆抗体技术的基本原理是杂交瘤技术，即通过将具有分泌特异性抗体能力的B淋巴细胞与可以无限繁殖的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞既能够保持B淋巴细胞的抗体分泌能力，又能够像骨髓瘤细胞一样无限繁殖。
通过在96孔板中进行克隆化培养，可以筛选出能够稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞，从而获得单克隆抗体。
二、孔板特点96孔板是单克隆抗体筛选中的常用工具，具有以下特点：1.96个孔洞，可同时培养多个杂交瘤细胞，提高筛选效率。
2.每个孔洞的体积较小，可减少培养基和细胞的用量，降低成本。
3.孔板材质具有良好的密封性和耐久性，保证培养环境的一致性。
4.便于机械自动化操作，可降低人为误差和提高实验可重复性。
三、细胞培养环境在96孔板中进行单克隆细胞筛选时，需要提供适宜的培养环境，以保证细胞的生长和分泌抗体的稳定性。
培养环境主要包括：1.培养基：选用适当的培养基配方，以保证细胞的营养需求。
2.温度：保持恒定的温度，通常为37℃。
3.湿度：维持相对湿度，以保证孔板表面适度湿润。
4.CO2浓度：控制培养环境中的CO2浓度，以维持pH值的稳定。
四、筛选方法在96孔板中进行单克隆细胞筛选的方法主要包括以下步骤：1.细胞接种：将杂交瘤细胞接种于96孔板中，每个孔洞接种一个细胞。
2.培养：在适宜的培养环境下进行细胞培养，使细胞增殖并分泌抗体。
3.检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测各孔洞中细胞的抗体分泌量。
4.阳性孔筛选：筛选出抗体分泌量较高的阳性孔洞中的细胞。
5.克隆化培养：对阳性孔洞中的细胞进行克隆化培养，以获得稳定分泌所需抗体的单克隆细胞。
6.检测与验证：通过进一步的检测和验证，确认所获得的单克隆细胞的特异性和稳定性。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。
e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法单克隆抗体检测方法是一种常用的实验技术，用于检验抗体的特异性和亲和力。
以下是几种常用的单克隆抗体检测方法：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：免疫组化是一种常见的单克隆抗体检测方法，用于检测组织学样本或细胞涂片中特定分子的表达情况。
该方法利用免疫反应来检测抗原-抗体的结合。
首先，将样品固定在载玻片上，然后用单克隆抗体特异地结合目标抗原。
通过可视化标记物，如酶或荧光标记物，可以检测到抗原-抗体的结合，从而实现对特定分子的检测。
2. 免疫印迹（Western Blotting）：免疫印迹是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于分析蛋白质的存在和相对数量。
在这个方法中，蛋白质样本通过电泳分离，并转移到薄膜上。
然后，薄膜与特异的单克隆抗体结合，用于检测目标蛋白质的存在。
最后，通过可视化标记物实现目标蛋白质的检测。
免疫印迹可用于研究蛋白质的表达量、分子量和剪接变异等。
3. 流式细胞术（Flow Cytometry）：流式细胞术是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于检测细胞表面标记物的存在和表达水平。
在这个方法中，通过单克隆抗体标记标记物，然后通过激光照射悬浮在流式细胞仪中的细胞。
细胞经过激光激发后，通过检测散射和荧光信号，可以确定单个细胞的性质和数量。
流式细胞术广泛应用于细胞免疫学和细胞生物学中。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：免疫沉淀是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于富集靶蛋白及与其相互作用的蛋白质。
在这个方法中，样品中的蛋白质与特异的单克隆抗体结合形成免疫复合物。
然后，通过添加沉淀剂，如蛋白A/G琼脂糖，将免疫复合物富集并沉淀下来。
最后，通过洗涤和分离，可以得到蛋白质的纯化，并用其他方法进一步分析。
5. 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：酶联免疫吸附试验是一种常用的单克隆抗体检测方法，用于测定抗原或抗体的存在和浓度。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
单克隆抗体检测方法
单克隆抗体检测方法
单克隆抗体检测方法是一种用于检测特定分子的方法。
该方法使用经过精确制备的单克隆抗体（具有一致的抗体亚基和特异的抗原结合位点），可以高度特异地识别和结合目标分子。
单克隆抗体检测方法通常包括以下步骤：
1. 抗原制备：目标分子（抗原）首先被制备和纯化，以便与抗体反应。
2. 抗体制备：针对目标分子，通过免疫动物（如小鼠或兔子）注射抗原，并从动物体内收集免疫细胞。
3. 细胞融合：将免疫细胞与癌细胞融合，形成称为杂交瘤（hybridoma）的细胞群。
4. 克隆筛选：通过稀释法或单细胞悬浮法，将杂交瘤细胞分离并培养成单克隆细胞系。
然后，对每个细胞系进行特异性和亲和性筛选，以选择特异性最好的单克隆抗体。
5. 抗体生产：选定的单克隆抗体细胞系被扩大培养，并收集抗体。
6. 抗体标记：单克隆抗体可用于标记分子。
这可通过化学方法（如生物素标记、
荧光标记等）或生物技术方法（如重组蛋白标记或酶标记）来完成。
7. 抗原检测：标记的单克隆抗体与目标分子反应，形成特异性的结合，然后用适当的方法测量标记物，以确定抗原的存在和浓度。
单克隆抗体检测方法具有高度特异性和灵敏度，并且可用于诊断疾病、检测药物和生物分子等许多应用领域。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取L Na2CO3 8ml，L NaHCO3 17ml混合，再加75ml 蒸馏水，调PH至。
Tris-HCl缓冲液（，L）：取L Tris 100ml，L HCl 混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（的PBS）：KH2PO4 ，KCl ，Na2HPO4·12H2O ，NaCl ，Tween-20 ，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA），加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水，滴加浓硫酸（98%）。
e、底物缓冲液（，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取L Na2HPO4 ，L柠檬酸，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml），底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS ，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的主要步骤单克隆抗体是一种由单一源头的B淋巴细胞分泌的抗体，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备过程可以分为六个主要步骤，包括免疫原选择、免疫动物免疫、细胞融合、筛选和克隆、生物制剂和表征以及大规模生产。
第一步是免疫原选择。
在制备单克隆抗体之前，需要选择适合的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他生物分子。
选择合适的免疫原对于获得高亲和力和特异性的单克隆抗体至关重要。
第二步是免疫动物的免疫。
通常使用小鼠作为免疫动物，将免疫原注射到小鼠体内，刺激其免疫系统产生抗体。
免疫过程可以持续数周或数月，以确保免疫系统充分产生抗体。
第三步是细胞融合。
细胞融合是将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞具有不受限制的生长能力，而免疫小鼠的B淋巴细胞则具有产生抗体的能力。
细胞融合可以通过化学方法或电融合方法完成。
第四步是筛选和克隆。
在细胞融合后，需要筛选出产生单一抗体的杂交瘤细胞。
常用的筛选方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和细胞流式细胞术。
通过这些筛选方法，可以鉴定出产生特定抗原抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化处理。
第五步是生物制剂和表征。
单克隆抗体的生物制剂包括抗体纯化和浓缩。
纯化可以通过亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法进行。
表征是对单克隆抗体进行验证，包括亲和力测定、特异性检测、结构分析等。
最后一步是大规模生产。
一旦获得了单克隆抗体的正式生物制剂和表征结果，就可以进行大规模的生产。
大规模生产通常采用细胞培养技术，通过培养细胞株来产生大量的单克隆抗体。
生产的单克隆抗体可以用于临床治疗、诊断试剂的生产以及科研领域的应用。
总结起来，制备单克隆抗体的主要步骤包括免疫原选择、免疫动物免疫、细胞融合、筛选和克隆、生物制剂和表征以及大规模生产。
这些步骤的顺序和细节可能会有所不同，取决于具体的实验目的和方法。
制备单克隆抗体需要耗费时间和精力，但它可以提供高度特异性和亲和力的抗体，对于生命科学研究和医学应用具有重要意义。
几种单克隆抗体表位的分析方法综述-免疫学论文-基础医学论文-医学论文
几种单克隆抗体表位的分析方法综述-免疫学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性，已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。
单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位，确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。
本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法，包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述。
关键词：单克隆抗体；抗原表位；酶联免疫吸附试验；噬菌体随机肽库；X-射线晶体学；丙氨酸扫描；氢氘交换质谱；生物信息学；单克隆抗体技术的出现不仅促进了免疫学的发展，也促进了许多其他学科的发展，该技术广泛用于医学领域，已成为重要的临床诊断手段和有效的药物治疗方法[1], 特别是治疗性单克隆抗体已成为近几年来生物制药业发展最快的领域之一[2], 同时，也为一些新技术提供了基础平台，如抗体偶联药物[3]、双特异性抗体[4]及新兴的CAR-T细胞治疗[5-6].由于单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性，极大改变了医学实践，提高了病患的生存质量，挽救了更多患者的生命。
单克隆抗体作为一种治疗恶性肿瘤和炎症性疾病的被动免疫制剂进入临床使用，再进一步发展至其他领域，包括神经系统疾病（如阿尔兹海默病等）及自身免疫疾病（如红斑狼疮等）[7].抗体功能取决于其与靶抗原结合的表位，表位是抗原的一部分，与抗体的可变区结合，与不同表位结合发挥特定的功能，这些功能可能表现为抑制活性或激活某个信号等。
单克隆抗体的表位分析能促进抗体治疗的发展，指导疫苗的设计，评估免疫者体内保护性抗体的反应，或是定位抗菌剂作用于病原微生物的靶点[8].单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位，确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中关键步骤[9].同时，可进一步分析这类表位的差异，正确评价单克隆抗体的特异性和交叉反应性，可用于评价某抗原表位是某种菌株不同血清型的共同表位，还是特异表位。
单克隆抗体筛选原理
单克隆抗体筛选原理单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的具有高度特异性和一致性的抗体。
在生物学研究和医学诊断中，单克隆抗体因其特异性和灵敏度被广泛应用。
本文将介绍单克隆抗体的筛选原理，包括抗原-抗体反应、筛选阳性克隆、克隆扩增、抗体纯化和抗体鉴定等方面。
一、抗原-抗体反应抗原-抗体反应是单克隆抗体筛选的基础。
抗原是指能够与抗体结合的物质，具有特异的抗原表位。
抗体是由B细胞产生的免疫球蛋白，能够识别并结合抗原表位。
抗原-抗体反应具有高度特异性和可逆性，是免疫学检测中最常用的反应之一。
二、筛选阳性克隆在单克隆抗体的制备过程中，首先需要筛选出能够产生所需抗体的阳性克隆。
通常采用有限稀释法将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得大量的杂交瘤细胞。
通过筛选，选出能够产生所需抗体的阳性克隆。
三、克隆扩增筛选出的阳性克隆需要进行克隆扩增，以获得足够数量的细胞产生抗体。
通常采用有限稀释法或连续传代法进行克隆扩增，使杂交瘤细胞在培养基中增殖，产生大量的单克隆抗体。
四、抗体纯化获得的单克隆抗体往往含有杂质，如蛋白质、DNA等，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括蛋白质A柱层析法、凝胶过滤法和离子交换层析法等。
这些方法能够将抗体与杂质分离，获得高纯度的单克隆抗体。
五、抗体鉴定纯化后的单克隆抗体需要进行鉴定，以确保其特异性和活性。
鉴定方法包括抗原结合试验、免疫荧光法、ELISA等。
通过这些方法可以检测单克隆抗体的特异性、亲和力和生物学活性，确保其适用于生物学研究和医学诊断。
总之，单克隆抗体的筛选原理主要包括抗原-抗体反应、筛选阳性克隆、克隆扩增、抗体纯化和抗体鉴定等方面。
通过对这些过程的了解和掌握，可以制备出高质量的单克隆抗体，为生物学研究和医学诊断提供有力的工具。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。
e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O20.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
单克隆抗体纯化过程
单克隆抗体纯化过程引言单克隆抗体是一种高度特异性的蛋白质，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
单克隆抗体的纯化是制备高纯度、高活性的单克隆抗体的关键步骤之一。
本文将详细介绍单克隆抗体纯化过程及其相关技术。
单克隆抗体纯化过程1. 细胞培养与收获单克隆抗体的制备首先需要进行细胞培养。
通常使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）作为表达宿主，将表达目标单克隆抗体的重链和轻链基因转染到CHO细胞中。
经过适当的培养条件，使得CHO细胞表达目标单克隆抗体。
当细胞达到一定密度后，可以进行收获。
收获过程中，需要将培养基与细胞分离，并将细胞沉淀下来。
常用的方法有离心和滤液等。
2. 细胞破碎与抗体提取收获的细胞需要进行破碎，以释放细胞内的抗体。
细胞破碎可以通过超声波、高压均质器、刀式破碎机等方法实现。
破碎后的细胞溶液中含有目标单克隆抗体、细胞碎片和其他杂质。
为了提取目标单克隆抗体，需要进行固液分离。
常用的方法有离心和滤液等。
离心可以将细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，而滤液可以去除较小颗粒的杂质。
3. 亲和层析亲和层析是单克隆抗体纯化过程中最常用的方法之一。
通过利用抗体与特定配体（如蛋白A或蛋白G）之间的特异性结合，将目标单克隆抗体选择性地吸附到固定在亲和树脂上的配体上。
亲和层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将亲和树脂与缓冲液进行平衡，以确保树脂处于最佳状态。
- 样品加载：将含有目标单克隆抗体的样品加入亲和树脂中，使得抗体与配体结合。
- 洗脱：使用特定的洗脱缓冲液，将非特异性结合的杂质洗脱，保留目标单克隆抗体。
- 再生：通过使用再生缓冲液，将目标单克隆抗体从亲和树脂上解离下来，以便进行下一轮层析。
4. 尺寸排阻层析尺寸排阻层析是一种基于分子大小差异的纯化方法。
通过利用填充在柱子中的尺寸排阻树脂，较大分子（如聚合物）被排除在外，而较小分子（如单克隆抗体）则可以通过树脂。
这样可以有效去除聚合物等大分子杂质。
尺寸排阻层析通常包括以下步骤： - 树脂平衡：将尺寸排阻树脂与缓冲液进行平衡。
单克隆抗体浓度测定方法
单克隆抗体浓度测定方法单克隆抗体浓度测定单克隆抗体浓度测定是一项关键的实验技术，用于确定单克隆抗体在样本中的浓度。
本文将介绍几种常用的测定方法。
ELISA法ELISA法是最常用的单克隆抗体浓度测定方法之一。
以下是ELISA 法的步骤：1.涂覆：将抗原溶液均匀涂覆在酶标板上。
2.固定：将酶标板放置在低温环境中，使抗原固定在酶标板上。
3.阻断：加入非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.反应：加入待测样本和单克隆抗体试剂，并孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使酶标板上的酶催化反应发生显色。
7.停止反应：加入停止剂，停止酶催化反应。
8.测定：用酶标仪测定反应溶液的吸光度，根据标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
Western Blot法Western Blot法也被广泛应用于单克隆抗体浓度测定。
以下是Western Blot法的步骤：1.蛋白质电泳：将待测样本和已知浓度的单克隆抗体样品进行SDS-PAGE电泳分离。
2.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯二醇膜（PVDF）上。
3.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.孵育：加入标记有特异单克隆抗体的二抗，孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤膜，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使特定蛋白质产生显色反应。
7.测定：用图像分析系统测量显色带的强度，根据已知浓度的单克隆抗体样品构建标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
免疫组化法免疫组化法是通过单克隆抗体与待测样本中的特定抗原结合来测定单克隆抗体浓度的方法。
以下是免疫组化法的步骤：1.取样：采集待测样本，如血液或组织切片。
2.固定：使用适当的固定剂将样本固定在载玻片上。
3.渗透：使用适当的加热或酶处理方法，增加抗体对抗原的渗透性。
4.成像：加入标记有荧光物质或酶标记的单克隆抗体试剂，与样本中的特定抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的物质。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则引言：单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是一种由单一细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力，被广泛应用于医学研究和临床治疗。
然而，为了确保单克隆抗体的质量和安全性，需要建立一套严格的质量控制技术指导原则。
本文将详细介绍人用单克隆抗体质量控制技术的原则和方法。
一、生产过程质量控制1. 细胞系的选择和鉴定选择适合的细胞系是制备高质量单克隆抗体的关键。
应选择已经鉴定并验证的细胞系，确保其稳定性和一致性。
常用的细胞系包括CHO细胞和NS0细胞等。
2. 培养条件的优化为了获得高产量和高质量的单克隆抗体，需要对培养条件进行优化。
包括培养基的配方、温度、pH值、气体环境等。
此外，还需要对培养过程中的营养物质和代谢产物进行监测和控制。
3. 细胞培养过程监测监测细胞培养过程中的关键参数，如细胞密度、细胞活力、细胞代谢产物等。
通过定期取样并进行分析，及时发现并解决问题，确保培养过程的稳定性和一致性。
4. 细胞培养过程中的污染控制细胞培养过程中的污染会对单克隆抗体的质量产生严重影响。
因此，需要采取措施防止细菌、真菌和病毒的污染。
包括严格的无菌操作、培养基和培养器具的消毒等。
二、单克隆抗体质量控制1. 抗体纯化和纯度分析单克隆抗体的纯化是确保其质量的重要步骤。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
纯化后，需要对抗体的纯度进行分析，如SDS-PAGE和Western blot等。
2. 抗体活性和特异性检测抗体的活性和特异性是评估其质量的关键指标。
常用的检测方法包括ELISA、流式细胞术和免疫组化等。
通过与目标抗原的结合能力和特异性进行检测，评估抗体的活性和特异性。
3. 抗体稳定性评估抗体的稳定性是其在储存和使用过程中的重要性能之一。
需要对抗体在不同条件下的稳定性进行评估，如温度、pH值和离子强度等。
通过稳定性评估，确定抗体的适宜储存条件和有效期限。
单克隆抗体的实验流程
单克隆抗体的实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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体外诊断用单克隆抗体的制备方法
体外诊断用单克隆抗体的制备方法单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，可以用于体外诊断、治疗和研究等领域。
制备单克隆抗体的方法有很多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
本文将介绍体外诊断用单克隆抗体的制备方法。
一、抗原的制备制备单克隆抗体的第一步是制备抗原。
抗原是一种能够诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等。
在体外诊断中，常用的抗原有病毒、细菌、肿瘤标志物等。
抗原的制备需要根据具体的实验目的和抗原的性质进行选择。
二、制备单克隆抗体的方法1.小鼠脾细胞和肿瘤细胞的融合制备单克隆抗体的最常用方法是杂交瘤技术。
该技术是将小鼠脾细胞和肿瘤细胞进行融合，形成一种能够长期生长并分泌单一种抗体的细胞系。
具体步骤如下：（1）收集小鼠脾脏细胞将小鼠免疫抗原后，收集其脾脏细胞。
脾脏是机体免疫细胞的主要器官，其中包含大量的淋巴细胞和浆细胞，是制备单克隆抗体的重要来源。
（2）收集肿瘤细胞选择一种能够长期生长并分泌免疫球蛋白的肿瘤细胞，如骨髓瘤细胞SP2/0、NS0等。
这些细胞具有高度的分泌能力和稳定的染色体组成，是制备单克隆抗体的理想细胞系。
（3）融合小鼠脾细胞和肿瘤细胞将小鼠脾细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使其融合成为杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的免疫特性和肿瘤细胞的分泌能力，能够长期生长并分泌单一种抗体。
2.筛选单克隆抗体融合后的杂交瘤细胞称为杂交瘤克隆，其中包含大量的杂交瘤细胞，每个细胞分泌的抗体可能不同。
为了筛选出单一种抗体，需要进行以下步骤：（1）限制性稀释将杂交瘤细胞进行限制性稀释，使其分散在培养皿中，每个细胞单独生长。
这样可以保证每个细胞分泌的抗体都是单一种类。
（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）将抗原固定在微孔板上，加入杂交瘤细胞上清液，进行酶联免疫吸附试验。
通过检测吸附到微孔板上的抗体种类和数量，筛选出分泌目标抗体的杂交瘤克隆。
（3）限制性稀释将筛选出的杂交瘤克隆进行限制性稀释，使其分散在培养皿中，每个细胞单独生长。
筛选单克隆抗体的方法
筛选单克隆抗体的方法
单克隆抗体是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的重要
工具。
然而，如何从众多的抗体中筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体一直是一个具有挑战性的问题。
下面介绍几种主要的筛选单克隆抗体的方法。
1. 杂交瘤技术
杂交瘤技术是制备单克隆抗体最常用的方法。
它包括四个主要步骤：免疫动物、细胞融合、筛选和克隆化。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，但其缺点是制备周期长、成本高，且适用范围受到制备抗原的限制。
2. phage display技术
phage display技术是一种通过噬菌体展示抗原表位以筛选单克隆抗体的方法。
在该方法中，抗体基因库被插入到噬菌体表面的蛋白质中，然后通过筛选可以筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体。
该方法的优点是速度快、成本低，且可以制备一系列不同抗原的单克隆抗体。
但其缺点是筛选的抗体可能存在亲和力较低或特异性较差的情况。
3. 单细胞PCR技术
单细胞PCR技术是一种通过单个B细胞进行PCR扩增和测序以制备单克隆抗体的方法。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，且可以避免杂交瘤技术中的克隆化步骤，但其缺点是制备周期长、成本高。
总体而言，筛选单克隆抗体的方法有多种，不同方法各有优缺点，选择合适的方法需要根据具体的实验要求进行评估。
单克隆抗体动态光散射 (dls)方法开发
单克隆抗体作为一种重要的生物药物，对其质量的监控至关重要。
动态光散射（DLS）作为常用的技术手段之一，用于评估单克隆抗体的聚集状态和稳定性。
本文将对单克隆抗体动态光散射方法的开发进行探讨。
一、背景1. 单克隆抗体的重要性单克隆抗体作为一类重要的生物药物，在治疗肿瘤、自身免疫性疾病等领域展现出了巨大的应用前景。
然而，由于单克隆抗体本身的复杂性和易发生的聚集现象，其质量控制面临着很大的挑战。
2. 动态光散射技术动态光散射技术是一种用于研究溶液中颗粒或分子的尺寸和尺寸分布的方法。
通过测量颗粒或分子在溶液中由于热运动而引起的光散射强度的变化，可以得出颗粒或分子的尺寸和分布情况。
二、单克隆抗体动态光散射方法的开发1. 样品处理在开展单克隆抗体动态光散射方法前，首先需要对样品进行处理，如通过离心等操作去除悬浮固体颗粒等，以保证测试结果的准确性。
2. 仪器优化开展动态光散射测试前，需要对仪器进行优化，包括仪器的参数设置、校准等操作，以确保测试的准确性和可重复性。
3. 测试条件在进行动态光散射测试时，需要考虑溶液的pH值、离子强度、温度等因素，这些因素对于单克隆抗体的聚集状态和稳定性具有重要影响。
4. 数据分析在得到动态光散射的数据后，需要进行合理的数据分析，包括颗粒或分子的尺寸、尺寸分布等参数的计算，并绘制相关的图表，以便更直观地了解样品的状态。
三、方法的应用与优势1. 应用单克隆抗体动态光散射方法可以用于监控单克隆抗体在制备过程中的聚集状态，评估其稳定性，并在药物研发、生产等环节中发挥重要作用。
2. 优势与传统的方法相比，单克隆抗体动态光散射方法具有操作简便、响应速度快、无需标记等优势，适用于不同类型的单克隆抗体药物的质量监控。
四、发展前景目前，随着单克隆抗体药物的研发和生产规模的不断扩大，对其质量的严格监控要求也日益增加。
单克隆抗体动态光散射方法的发展前景十分广阔。
未来，随着技术的进步和方法的不断优化，相信单克隆抗体动态光散射方法将在单克隆抗体药物质量控制领域发挥越来越重要的作用。
单克隆抗体等电点
单克隆抗体等电点
单克隆抗体（mAb）的一个重要特征是它们的等电点（pI），本质上是抗体不带净电荷时的pH值，该值取决于抗体所含的带电氨基酸。
如果周围环境的pH值低于抗体的pI，则该分子带有净正电荷，而当pH值高于pI时，抗体将带有净负电荷。
在评估治疗性抗体的药代动力学（PK）特性时，靶介导的药物处置（TMDD）与非靶标相关机制都会影响整体PK行为，pI是后者的重要因素。
由于大多数细胞表面带负电荷，抗体需要带正电荷以进行有效的液相内吞作用（胞饮作用），因此环境pH值需要低于抗体的pI。
常用的检测单克隆抗体等电点的方式有电聚焦凝胶电泳（IEF）、阳离子交换色谱（CEX）、阴离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。
等电点值反映了蛋白质药物电荷与空间构象的均一性。
在实际应用中，单克隆抗体等电点的准确测定对于抗体药物的生产和质量控制至关重要。
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常用的单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。
e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O20.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。
g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。
l、酶联免疫阅读仪；或光镜。
m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。
②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。
b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。
c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。
d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。
e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。
g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。
h、加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。
i、以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
j、结果判定：以P/N2.1，或PN+3D为阳性。
若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。
③全菌抗原的ELISASa、新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。
必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。
b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃2小时封闭。
c、步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul 封闭液4℃过夜或37℃2小时封闭。
d、洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
e、以下步骤同上法。
④用全细胞抗原的ELISAa、按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。
b、淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。
该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。
将该细胞悬液稀释至适当浓度。
c、每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。
d、以下步骤同上法。
⑤抗体捕捉ELISA试验本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。
该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：a、以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃2小时或4℃过夜。
b、洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃1-2小时。
c、洗涤后加适量的抗原，37℃1-2小时。
d、洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃1-2小时。
洗涤后加底物显色，判定结果。
⑥ABC-ELISA试验ABC-ELISA是在常规ELISA 原理的基础上，增加了生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的放大作用。
亲和素有4个亚单位组成，对生物素有高度的亲合力。
生物素很易与蛋白质共价结合。
因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。
其操作步骤如下：a、已知抗原的包被及加待检McAb 样品，同间接ELISA试验。
b、加生物素化抗鼠Ig抗体，每孔100ul，37℃1小时；洗涤。
c、加酶标亲和素，每孔100ul，37℃30分钟洗涤；加底物显色，判定结果。
⑦Dot-ELISA 试验免疫斑点试验（Dot-ELISA）是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。
该法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。
根据所用的标记物不同，可分为HRP 免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。
其操作步骤大致如下：a、将抗原液2-5ul点加于纤维素膜上，室温37℃干燥。
b、将纤维膜浸入封闭液中，37℃30分钟。
c、用洗涤液洗2次，吸干后加待检McAb样品，37℃1小时；用洗涤液振荡洗涤三次，每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记的抗鼠Ig抗体，37℃作用30分钟。
d、同法洗涤，吸干，用新配的相应底物溶液显色，然后水洗终止反应，观察结果。
⑧免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb，常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技术。
其结果用光镜或倒置显微镜检查。
（2）免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。
其操作简单、敏感性高，可直接观察抗原定位等优点，在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。
①器材和试剂a、供检测抗体用的抗原制备固定细胞片或板，活细胞悬液。
b、PBS（PH7.2，0.01mol/L）c、待检的McAb样品。
d、冷丙酮e、FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记的抗鼠Ig抗体等f、荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。
②间接免疫荧光法a、固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃丙酮固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
细胞涂片的制备：将10ul细菌悬液（1×108个/ml）涂抹7×21mm盖片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分钟，于-20℃保存备用。
b、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5-1小时。
c、取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d、盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。
e、同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。
f、光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。
g、细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。
③细胞的膜荧光染色完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。
如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。
必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。
活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：a、制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。
b、在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。
c、用洗涤液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。
加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。
d、同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。
e、立即在荧光显微镜上检查。
f、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周。
（3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。
本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。
可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。
①器材和试剂a、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。