蛋白质组学常见问题
蛋白质组学质谱问题个人总结
1.色谱柱中为什么极性大(盐)的组分要用极性较大的溶剂洗脱吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。
对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。
供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种,本实验选择中性氧化铝。
化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强。
对氧化铝的吸附性递减:酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃。
先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中,选用的溶剂极性要低,体积要小。
如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小,则可加入少量极性较大的溶剂,使溶液体积不致太大。
色层的展开首先使用极性较小的溶剂,使最容易脱附的组分分离。
然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂,将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来.2.反相色谱,是非极性固定相和极性流动相,用于分离非极性或者弱极性物质。
我想请教的是,如果流动相极性偏大,是不是分离效果不好?还有就是如果分离度不好,加大水的比例,延长保留时间,会不会影响到分离效果?对于液相色谱分离,影响因素多,有两点因素最影响分离,第一是物质与流动相的极性,第二个叫洗脱能力:出峰快与慢以及分离效果,用极性来理解出峰顺序,反相色谱一般使用强度因子来表示,一般极性参数大的,强度因子就小,但甲醇与乙腈比较特殊,极性参数甲醇与乙腈分别为5.1与5.8,强度因子却是甲醇3.0,乙腈3.2。
临床蛋白质组学 缺失值
临床蛋白质组学缺失值
在临床蛋白质组学中,缺失值是指在蛋白质组数据集中缺少的值。
缺失值可能是由于实验技术的限制、实验操作的不确定性或者数据处理过程中的错误等原因导致的。
缺失值在临床蛋白质组学中是一个常见的问题,因为蛋白质组学技术本身的复杂性和挑战性。
处理缺失值的正确方法对于准确分析和解释蛋白质组数据非常重要。
下面是一些常见的处理临床蛋白质组学中的缺失值的方法:
1. 删除缺失值:简单粗暴地将含有缺失值的样本或特征删除。
这种方法适用于缺失值占比较小的情况,但可能会导致数据的损失和偏差。
2. 填充缺失值:使用一些统计方法来估计缺失值。
填充方法可以包括均值填充、中位数填充、众数填充、回归填充等。
这种方法可以保留更多的数据信息,但可能会引入估计偏差。
3. 插值方法:使用插值方法来填充缺失值,如线性插值、多项式插值、样条插值等。
这种方法可以更准确地估计缺失值,但对数据分布假设要求较高。
4. 缺失值模型:建立更复杂的模型来估计缺失值。
例如,可以基于其他特征来预测缺失值,使用机器学习方法或深度学习方法等。
这种方法可以更精确地估计
缺失值,但计算成本较高。
在选择处理缺失值的方法时,需要根据具体数据集的情况和研究问题的要求来决定。
同时,还需要注意处理缺失值可能引入的偏差和不确定性,以及对结果解释的影响。
蛋白质组学研究基本策略
蛋白质组学研究基本策略蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的总体组成、结构和功能的一种科学研究方法。
由于蛋白质是生物体内最重要的基本构建单元之一,它们在细胞代谢、信号传递、基因表达调控、代谢调节、免疫防御等方面发挥着重要的作用。
近年来,随着高通量分析技术的应用和发展,蛋白质组学研究已成为生命科学研究的重要分支之一,它可以帮助我们更加深入地了解生物体的生理和病理过程,为生物医学和生物技术的研究提供了强有力的工具支持。
蛋白质组学的基本策略主要涉及样品处理、蛋白质分离、蛋白质质量鉴定和蛋白质表达谱分析等方面,下面我们将对这些方面进行详细介绍。
一、样品处理样品处理是蛋白质组学研究中非常重要的环节之一,它直接关系到后续的蛋白质分离和鉴定结果。
样品处理的目的是将样品中的蛋白质分离出来,同时去除其中的其他干扰物和噪声。
在样品处理过程中,有一些重要的指标需要考虑,比如选择合适的裂解方式、针对不同类型样品采用不同的前处理方法、去除样品中的盐、肉眼可见颗粒等物质,同时也需要进行蛋白质质量的检测,确保样品中蛋白质的浓度和完整性。
二、蛋白质分离在样品处理之后,需要对样品进行蛋白质分离。
蛋白质分离的目的是将样品中的蛋白质获得比较纯净的组分,并使蛋白质真实且广泛地表达。
蛋白质分离的方法很多,其中电泳是一种非常常用的方法,它可以通过不同的电泳技术和硅胶柱层析技术将复杂的蛋白质混合物分离成单独的组分。
电泳的种类包括:SDS-PAGE、二维电泳等等。
在蛋白质分离过程中,还需要注意分离后蛋白质组分的集中度、分辨度,并进行蛋白质谱图的理解。
三、蛋白质质量鉴定鉴定蛋白质的质量是蛋白质组学研究的核心步骤之一。
蛋白质质量的鉴定可以通过不同的方法来实现,比如西方印迹、MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS等技术。
这些技术不仅可以鉴定蛋白质的分子量、差异分子、台阶分子等特点,还可以分析蛋白质的化学性质、生理功能等方面的信息。
四、蛋白质表达谱分析蛋白质表达谱的分析是利用上述鉴定方法,对大规模蛋白质样品进行分析,并确定不同样品蛋白质谱图的变化趋势,从而揭示蛋白质数量和质量的组成成分比例。
蛋白质表达研究中的难点和挑战
蛋白质表达研究中的难点和挑战蛋白质是生物体中不可或缺的组成部分,它们在细胞中扮演着重要的功能角色。
研究蛋白质表达,即在生物体内合成蛋白质的过程,是生物医学科学领域中的一个重要研究方向。
然而,在进行蛋白质表达研究时,研究人员面临着一些难点和挑战。
本文将介绍蛋白质表达研究中的一些常见难点,并探讨如何应对这些挑战。
一、蛋白质结构复杂多样的挑战蛋白质的结构复杂多样,包括氨基酸序列、三维结构以及其所处的细胞环境等。
对于研究人员来说,了解蛋白质结构对于准确表达目标蛋白质至关重要。
然而,确定蛋白质的准确结构是一项相当困难的任务。
许多蛋白质的结构尚未被完全解析,或者存在变异和异常表达。
这为蛋白质表达研究带来了挑战,需要针对具体蛋白质结构的特点进行设计和优化。
二、蛋白质表达的低产量和不稳定性在蛋白质表达中,研究人员常常面临低产量和不稳定性的问题。
很多目标蛋白质在表达时难以得到足够的产量,甚至无法进行充分表达。
此外,有些蛋白质在表达过程中容易失去折叠或聚集成大量的非功能性物质,从而难以获取纯净的目标蛋白质。
这些问题不仅会延长研究时间,还会增加实验的复杂性和成本。
因此,提高蛋白质表达的产量和稳定性是一个重要的挑战。
三、选择适合的表达系统在蛋白质表达研究中,选择适合的表达系统是一个关键的决策。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
不同的表达系统具有各自的特点和优势,因此选择合适的表达系统对于获得高效的目标蛋白质表达至关重要。
然而,确定适合的表达系统需要综合考虑蛋白质的生理特性、表达需求以及其它实验条件的限制。
这需要研究人员具备丰富的经验和专业知识。
四、后续处理和纯化的困难蛋白质表达的成功并不意味着表达的蛋白质已经满足研究的需求。
在蛋白质表达后,研究人员需要进行后续的处理和纯化步骤,以获得纯净的目标蛋白质。
这些步骤通常包括分离、浓缩、纯化和结晶等过程。
然而,这些步骤可能会影响蛋白质的结构和功能,导致实验结果的偏差。
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究方法蛋白质组学是运用先进的分析技术,通过对细胞内的蛋白质分子进行检测、分离、同位素标记与定量等方法,研究不同细胞型、组织型、发育阶段以及病变状态等生物样本中蛋白质组成及其功能性调控的科学。
它是一门综合性学科,既涉及生物化学、蛋白质工程、分子生物学等学科,也涉及信息学及计算机科学等学科,运用了各种生物学技术和数学模型,将复杂的生物体蛋白质组织成一个有机的整体,从而更好地了解蛋白质的结构与功能关系。
蛋白质组学的研究方法主要包括:一、蛋白质分离与鉴定:蛋白质分离是蛋白质组学的基础步骤,其目的是从生物样本中提取蛋白质。
常用的技术包括凝胶电泳、膜分离、微萃取、液相色谱法以及离心分离等。
蛋白质分离之后,还需要进行鉴定,以获得蛋白质的名称及其细胞定位等信息,以便进行后续研究。
常用的方法包括凝集试验、蛋白质印迹、Western blotting、质谱分析以及二级结构分析等。
二、定量蛋白质组学:定量蛋白质组学是指利用有效的检测技术,对生物样本中的蛋白质进行定量分析,以便获得蛋白质组成及其功能性调控情况的精确信息。
定量蛋白质组学技术主要包括酶标记蛋白质定量、质谱定量以及流式细胞蛋白质定量等。
三、蛋白质组学的应用:蛋白质组学的研究结果可以用来研究基因调控、细胞信号转导、疾病机理等方面的问题。
它可以帮助研究人员更好地理解生物的复杂性,并为有效的治疗策略的制定提供重要的参考和指导。
它还可以用于研究新型药物的研究和开发,为疾病的治疗提供新的思路。
蛋白质组学的发展前景广阔,它不仅可以用于解决当前生物学上的实际问题,还可以为未来的研究提供重要的科学研究基础。
随着技术的进步和数据量的增加,蛋白质组学技术将会为生物学研究带来更多的惊喜和发现。
蛋白质组学常见问题
HPLC 篇1 . HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足:解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出:可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配:根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多:调整衰减即可。
检测器时间常数太大:解决办法为降低时间参数检测器池窗污染:解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡:解决办法为排气。
记录仪测压范围不当:调整电压范围即可。
流动相流量不合适:调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线:解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
2 .做 HPLC 分析时,柱压不稳定,原因何在? 如何解决?原因可能有: ?泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;比例阀失效,更换比例阀即可。
泵密封垫损坏,更换密封垫即可。
溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;系统检漏,找出漏点,密封即可。
梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
3 .我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高,请问为什么?柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上,用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子, ( 此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动性 ) 。
这时,如果柱压仍不下降,再检查;更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高,请与厂商联系。
一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题, SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 .液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。
蛋白质组学 数据预处理
蛋白质组学数据预处理简介蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的总体组成、结构和功能的科学领域。
在蛋白质组学研究中,数据预处理是非常重要的一步,它涉及到对原始数据进行清洗、校正和标准化等操作,以确保后续分析的准确性和可靠性。
本文将详细介绍蛋白质组学数据预处理的流程和方法,并提供一些常用的工具和技术。
数据清洗数据清洗是蛋白质组学数据预处理的第一步,其主要目标是去除无效或错误的数据,以提高后续分析的可信度。
缺失值处理在实际应用中,蛋白质组学实验往往会产生大量的缺失值。
缺失值可能是由于实验操作、仪器故障或其他原因导致的。
处理缺失值时,可以采取以下几种常见方法:1.删除含有缺失值的样本:如果某个样本中存在大量缺失值,可以考虑将该样本从分析中删除。
2.删除含有缺失值的特征:如果某个特征在大部分样本中都存在缺失值,可以考虑将该特征从分析中删除。
3.填充缺失值:对于某个特征中的少量缺失值,可以使用插值法(如均值、中位数或回归模型)来填充。
异常值处理异常值是指与其他观测值明显不同的数据点。
在蛋白质组学数据中,异常值可能是由于实验误差、技术问题或其他原因导致的。
处理异常值时,可以采取以下几种常见方法:1.删除异常值:如果某个观测值明显偏离其他观测值,可以考虑将其删除。
2.替换异常值:对于某个观测值较为极端但仍具有一定意义的情况,可以考虑用均值、中位数或其他合理的替代值来代替异常值。
数据标准化数据标准化是将原始数据转化为具有统一尺度的数据,以便后续分析和比较。
在蛋白质质谱数据中,常见的标准化方法包括:1.最大最小归一化:将数据线性映射到[0, 1]区间内。
2.Z-score标准化:通过计算数据与其均值之间的差异,并除以标准差,将数据转化为标准正态分布。
3.小数定标标准化:将数据除以一个固定的基数,如10的幂次,以确保数据位于[-1, 1]或[0, 1]区间内。
数据校正数据校正是蛋白质组学数据预处理的第二步,其主要目标是消除由于技术偏差、仪器漂移或其他原因导致的系统误差。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤,它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而,在蛋白质表达的过程中,常常会遇到一些问题,这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题,并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中,选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌(E. coli)、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法:根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质,E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质,可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外,还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株,优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础,如果无法正确地折叠,可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下,蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法:针对无法正确折叠的蛋白质,可以考虑使用分子伴侣(chaperone)辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子,通过与目标蛋白质相互作用,帮助其正确折叠,并防止其异常聚集。
此外,还可以优化表达条件,如温度、培养基成分等,以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标,特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而,很多时候表达产量较低,难以满足研究需求。
解决办法:提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先,可以优化表达载体和宿主菌株的选择,采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次,可以优化表达条件,如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外,还可以使用辅助表达因子,如融合标签或信号肽,来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后,需要对目标蛋白质进行纯化,以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
医疗行业中的蛋白质组学技术应用挑战分析
医疗行业中的蛋白质组学技术应用挑战分析近年来,蛋白质组学技术在医疗行业中得到了广泛的应用,为疾病诊断、新药研发和个性化医疗提供了有力的支持。
然而,蛋白质组学技术的应用也面临一些挑战。
本文将对医疗行业中蛋白质组学技术应用的挑战进行分析,并探讨解决这些挑战的可能途径。
首先,蛋白质组学技术在样本处理方面面临着许多技术性挑战。
样本处理是蛋白质组学研究的重要一环,直接影响到后续的质谱分析结果。
目前,对于大量样本的高通量分析仍然是一个技术难题。
同时,不同样本的复杂性和来源的多样性也给样本处理带来了挑战。
因此,研究人员需要不断改进和优化样本的前处理方法,提高样本的质量和稳定性。
其次,蛋白质组学技术在质谱分析方面还存在一些挑战。
当前的质谱分辨率和灵敏度已经相当高,但是在解析复杂样本中仍然面临困难。
特别是在分析低丰度蛋白质、修饰蛋白质以及蛋白质复杂组合物时,质谱信号可能被掩盖或干扰,造成分析结果的偏差。
因此,研究人员需要进一步改进质谱技术,提高质谱分辨率和灵敏度,以更好地解析复杂样本中的蛋白质。
此外,蛋白质组学技术在数据分析和解释方面也面临一些挑战。
由于蛋白质组学数据的高维度特性,数据处理和分析变得复杂而困难。
例如,在大规模蛋白质组学实验中,可能会产生成千上万个蛋白质鉴定结果,如何从中挑选出与研究目的相关的蛋白质是一个需要解决的问题。
此外,与基因组学等其他组学技术相比,蛋白质组学数据的解释性较差,很难从数据中获得深入的生物学信息。
因此,研究人员需要开发和改进合适的数据分析和解释方法,帮助科学家更好地理解和应用蛋白质组学数据。
解决这些挑战的途径可以通过多方面的努力来实现。
首先,加强蛋白质组学技术的基础研究,不断改进技术的前沿和精确度。
例如,开展新的样本处理方法的研究,提高样本处理的效率和质量;改进质谱技术,提高质谱分辨率和灵敏度;开发更高效的数据分析和解释方法,提高蛋白质组学数据的解释性。
其次,加强跨学科合作,促进蛋白质组学技术与其他技术和学科的融合。
蛋白质组学常见问题解答
1、iTRAQ和label-free所用的搜库软件及其版本、定量分析软件是否一致?答:搜库软件是不一致的:iTRAQ数据采用Mascot(2.3.0);label-free则是maxquant(1。
4。
1.2)。
2、iTRAQ/TMT和Label-free技术都有哪些优缺点?答:(1)定量准确性:iTRAQ/TMT的定量准确性和重现性要明显优于Label—free,Label-free的样本之间不能直接混合,导致定量的结果受到的影响因素多,因此定量结果的准确度较低;(2)鉴定通量:Label-free通量相对较高,而iTRAQ/TMT由于标记基团的影响,鉴定通量较label-free 低;(3)修饰组学:label-free定量,修饰肽段的富集(即IP)是各组分开进行的,很可能造成富集的不平行,最终造成定量不准确。
因此,我们通过加入内标肽段来归一化以减少富集步骤引入的误差。
而iTRAQ/TMT标记的修饰组,修饰肽段的富集是各组标记、混合后同时进行的,所以不会存在富集的不平行。
因此,修饰组的定量,iTRAQ/TMT方法的定量准确性优于label—free;(4)其它:目前泛素化修饰定量组学只能用label—free来做。
3、常用的蛋白质翻译后修饰参考数据库有哪些?4、HPLC分级的标准及作用是什么?是否组分越多通量越高?答:HPLC分级有两个目的:1。
降低每个组分中蛋白的复杂度,利于质谱鉴定;2.增加每个组分中每个蛋白的含量,同样利于质谱的鉴定。
组分的多少和样品的复杂程度有关,如果分级数太少,没有达到降低样品复杂度的作用,如果分级数目太多,反而会降低每个组分中每个蛋白的含量,并且组分越多蛋白损失越大,因此分级太少和太多都不利于质谱鉴定,我们公司的分级数目是经过系统考察得到的最优选择.5、公司目前使用的蛋白浓度测定方法是什么?答:我们的蛋白浓度测定使用GE公司的2D Quant kit完成,该试剂盒可耐受8 M urea和2% SDS,明显优于其它浓度测定方法。
蛋白质组学的分析方法和应用
蛋白质组学的分析方法和应用蛋白质是生物体中最基本的分子之一,其在生命过程中发挥着重要的作用,是细胞和组织的构建物,是许多代谢和信号途径的关键分子。
因此,研究蛋白质在生命过程中的作用和调控机制,是现代生命科学中的重要课题之一。
蛋白质组学作为研究蛋白质的全面组学方法,为我们深入了解蛋白质的基本特性、功能以及相关生物学问题提供了有力的工具。
本文将简要介绍蛋白质组学的分析方法和应用。
一、蛋白质组学的分析方法1.1 二维凝胶电泳(2-DE)2-DE是最早被广泛应用于蛋白质组学中的方法之一,它通过将复杂的蛋白质样品在等电聚焦电泳(IEF)和SDS-PAGE两个维度(尺寸和电荷)上分离,得到的二维图谱可以有效地展示样品中所有蛋白质的表达水平和不同状态下的修饰情况。
2-DE已被广泛运用于研究生长发育、药理学、毒理学、蛋白质交互作用及生物标记物等领域。
但是,由于其技术复杂度较高,对蛋白质量有一定的要求,且存在凝胶变形、充分难度等问题,因此在分离大分子蛋白质、疾病样本等方面,其应用受到一定限制。
1.2 质谱分析技术质谱分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要手段之一。
质谱分析技术主要包括两种:筛选谱与定量谱。
筛选谱主要指的是利用串联质谱(MS/MS)等多种技术,鉴定研究对象中的蛋白质结构、氨基酸序列、修饰和定位等信息,并用于生物流程寻找新的相关蛋白;定量谱利用同位素标记(ICAT、iTRAQ、TMT等)或标志(SILAC、AAV-TriCEPS等)技术,用于不同样本(实验组、对照组)之间的比较,研究生物过程中蛋白质的表达动态变化。
质谱分析技术具有高通量、高灵敏度、高分辨力、比较全面等特点,已被广泛运用于生物医药、制药工业、人类蛋白组学等领域。
1.3 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种利用微阵列技术,以蛋白质为谱的高通量、高效、高水平的蛋白质组学分析技术。
相比于传统方法,蛋白质芯片技术不需要精细的提取和分离蛋白样品,能够减少样品的消耗和实验的时间,同时具有高效筛选和快速获得大量蛋白质互作网络信息的优势。
蛋白质计算问题归类解析
蛋白质计算问题归类解析计算题是生物试题中常见题型之一。
蛋白质中氨基酸、氨基、羧基、肽链、肽键、脱水数、分子量等各因素之间数量关系复杂,为生物计算题型的命题提供了很好的素材。
现对此归类如下:1.有关蛋白质相对分子质量的计算例1组成生物体某蛋白质的20种氨基酸的平均相对分子质量为128,一条含有100个肽键的多肽链的分子量为多少?解析:在解答这类问题时,必须明确的基本关系式是:蛋白质的相对分子质量=氨基酸数×氨基酸的平均相对分子质量−脱水数×18〔水的相对分子质量〕此题中含有100个肽键的多肽链中氨基酸数为:100+1=101,肽键数为100,脱水数也为100,则依上述关系式,蛋白质分子量=101×128−100×18=11128。
变式1:组成生物体某蛋白质的20种氨基酸的平均相对分子质量为128,则由100个氨基酸构成的含2条多肽链的蛋白质,其分子量为〔〕A.12800B.11018C.11036D.8800解析:对照关系式,要求蛋白质分子量,还应知道脱水数。
由于题中蛋白质包含2条多肽链,所以,脱水数=100−2=98,所以,蛋白质的分子量=128×100−18×98=11036,答案为C。
变式2:全世界每年有成千上万人由于吃毒蘑菇而身亡,其中鹅膏草碱就是一种毒菇的毒素,它是一种环状八肽。
假设20种氨基酸的平均分子量为128,则鹅膏草碱的分子量约为( ) A.1024 B. 898C.880 D. 862解析:所谓环肽即指由首尾相接的氨基酸组成的环状的多肽,其特点是肽键数与氨基酸数相同。
所以,鹅膏草碱的分子量=8 ×128−8 ×18=880,答案为C。
2.有关蛋白质中氨基酸数、肽链数、肽键数、脱水数的计算在解答这类问题时,必须明确的基本知识是蛋白质中氨基酸数、肽链数、肽键数、脱水数的数量关系。
基本关系式有:n个氨基酸脱水缩合形成一条多肽链,则肽键数=(n−1)个;n个氨基酸脱水缩合形成m条多肽链,则肽键数=(n−m)个;无论蛋白质中有多少条肽链,始终有:脱水数=肽键数=氨基酸数−肽链数例2氨基酸分子缩合形成含2条肽链的蛋白质分子时,相对分子量减少了900,由此可知,此蛋白质分子中含有的氨基酸数和肽键数分别是〔〕A.52、52B.50、50C.52、50D.50、49解析:氨基酸分子形成蛋白质时相对分子质量减少的原因是在此过程中脱去了水,据此可知,肽键数=脱水数=900÷18=50,依上述关系式,氨基酸数=肽键数+肽链数=50+2=52,答案为C。
临床蛋白质组学 缺失值
临床蛋白质组学缺失值临床蛋白质组学是一门通过研究蛋白质在人体中的表达和功能变化来诊断和治疗疾病的领域。
在这个领域中,缺失值是一个常见的问题,因为在实验过程中,由于样本的限量或技术上的挑战,蛋白质组测量数据中往往会存在一些缺失值。
这些缺失值可能会对数据分析和结果解释造成影响。
了解和处理缺失值在临床蛋白质组学中至关重要。
在分析蛋白质组数据时,我们首先需要对缺失值的原因进行评估。
常见的数据缺失原因包括实验过程中的技术问题、样本处理和制备中的失败、以及分析过程中的一些混淆因素等。
了解数据缺失的原因可以帮助我们更好地进行后续的数据处理和分析。
为了处理缺失值,我们可以采取多种方法。
一种常见的方法是删除含有缺失值的样本或变量。
这种方法简单直接,但可能会导致样本数据的减少,从而可能影响结果的统计显著性和可靠性。
另一种常见的方法是使用插补方法来填充缺失值。
插补方法分为单变量和多变量插补。
单变量插补是指根据该变量在其他样本中的取值来估计缺失值。
常见的单变量插补方法有均值插补、中位数插补和最近邻插补等。
这些方法的缺点是忽略了其他变量之间的相关性。
相比之下,多变量插补方法考虑了其他变量之间的相关性,可以提供更准确的估计。
常见的多变量插补方法有岭回归和主成分分析等。
这些方法基于样本数据中已有的信息来预测缺失值,从而填补数据集中的空缺。
除了插补方法之外,还可以使用模型方法来处理缺失值。
模型方法通过建立模型来估计缺失值,例如使用线性回归模型或随机森林等。
这些模型可以利用已有数据的特征来预测缺失值,从而填补数据集中的空缺。
模型方法的优点是能够利用多个变量之间的关系,提供更准确的估计。
在处理缺失值时,我们还需要考虑到不同插补方法的优缺点。
单变量插补方法简单快速,但可能会忽略变量之间的相关性。
而多变量插补方法考虑了变量之间的相关性,但在处理大量缺失值时可能计算复杂度较高。
模型方法则需要建立合适的模型,对数据进行较为复杂的处理,但可以提供更准确的估计。
蛋白质纯化常见问题及解决方案
蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。
纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能,从而推动相关领域的研究进展。
然而,在进行蛋白质纯化的过程中,科学家们常常会遇到各种问题。
本文将介绍一些常见的问题,并提供解决方案,以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。
常见问题一:蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中,蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。
然而,有时候我们会发现蛋白质的表达量过低,难以获得足够纯度的样品。
这可能有以下几个原因:1. 载体选择不当:选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。
可以尝试使用高效表达载体,如pET系列载体,来提高蛋白质的表达量。
2. 菌株选择不当:不同菌株对蛋白质表达量有差异。
常用的菌株包括大肠杆菌(E.coli)和酵母菌等。
可以尝试不同菌株进行表达,找到最适合的菌株。
3. 条件优化不足:包括温度、培养基和诱导条件等。
合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案:针对上述问题,可以尝试优化表达载体、菌株和条件,并进行系统的优化实验。
此外,还可以尝试使用其他表达系统,如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。
常见问题二:蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性,因而导致降解、聚集或失活。
这种情况可能是由于多种因素造成的,例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。
解决方案:对于易聚集和不稳定的蛋白质,可以采取以下一些措施:1. 降低温度:将温度降低到4℃以下,可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。
2. 优化缓冲液:选择合适的缓冲液,并进行pH和离子强度的优化。
有时候添加一些辅助物质,如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂,可以提高蛋白质的稳定性。
3. 使用小分子化合物:有时候可以加入一些小分子化合物,如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等,来增强蛋白质的稳定性。
常见问题三:蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在,如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。
基因组和蛋白质组大数据分析挑战与方法总结
基因组和蛋白质组大数据分析挑战与方法总结大数据分析已经成为了生物学研究中不可或缺的一部分,特别是在基因组学和蛋白质组学领域。
随着高通量测序和高通量质谱分析技术的进步,生物学家们可以生成大量的基因组和蛋白质组数据。
然而,处理和分析这些大数据并从中提取有用的信息是一项艰巨的任务。
本文将讨论基因组和蛋白质组大数据分析中的挑战,并总结一些常用的方法。
一、挑战1.数据存储和管理:基因组和蛋白质组的大数据通常需要巨大的存储空间,并且需要经常访问和更新。
因此,在进行大数据分析之前,生物学家们需要建立高效的数据存储和管理系统,以确保数据的可靠性和安全性。
此外,大数据的存储和管理也需要考虑数据的备份和恢复机制,以防止数据丢失。
2.高维数据分析:基因组和蛋白质组数据通常包含大量的变量,这使得数据分析变得复杂和困难。
如何处理这些高维数据,并从中提取有意义的信息是一个具有挑战性的任务。
特别是在蛋白质组学中,蛋白质的复杂性和功能多样性增加了数据分析的难度。
3.数据清洗和预处理:生物学实验产生的大数据通常存在噪声和错误。
因此,在进行数据分析之前,生物学家们需要进行数据清洗和预处理,以排除这些异常值和错误数据。
数据清洗和预处理的过程需要运用统计学和机器学习的方法,以提高数据质量和准确性。
4.数据整合和交叉分析:基因组和蛋白质组数据通常来自于不同的实验和技术平台,这些数据需要进行整合和交叉分析,以寻找它们之间的关联和相互作用。
数据整合和交叉分析需要使用多种统计学和网络分析的方法,以揭示不同基因和蛋白质之间的功能和关系。
二、方法总结1.基因组数据分析方法:(1)基因表达分析:基因表达谱揭示了不同条件下基因的表达水平,常用的方法有基因芯片和RNA测序。
生物学家可以通过这些方法研究基因表达的调控机制和生物过程中的基因功能。
(2)基因组重测序:基因组重测序可以帮助研究人员探究生物体的基因组结构、突变和遗传变异等。
重测序方法如全基因组测序和基因组DNA甲基化测序提供了宝贵的信息,有助于了解基因组的功能和变异。
使用生物大数据技术解决蛋白质结构预测中的常见问题
使用生物大数据技术解决蛋白质结构预测中的常见问题生物大数据技术在蛋白质结构预测中的应用近年来得到了广泛关注,这是因为蛋白质结构的准确预测对于理解蛋白质功能与药物设计等领域具有重要意义。
然而,蛋白质结构预测中存在着一些常见问题,如结构多样性、函数注释和计算复杂性等。
借助生物大数据技术,研究人员已经取得了一些突破,使得蛋白质结构预测变得更加准确和高效。
首先,蛋白质的结构多样性是蛋白质结构预测中的一个常见问题。
蛋白质的结构特征包括许多因素,如二级结构、域间相互作用和螺旋转角等。
使用传统的实验方法进行蛋白质结构预测往往耗时且费力,而生物大数据技术可以通过整合大规模的基因组学和蛋白质组学数据,来推断蛋白质的结构多样性。
例如,通过生物大数据技术可以利用蛋白质序列的同源性进行结构预测,从而提高预测的准确性。
其次,蛋白质功能注释也是蛋白质结构预测中的一个重要问题。
蛋白质的功能通常与其结构密切相关,而蛋白质结构预测的准确性也对功能注释的精确性有着重要影响。
生物大数据技术可以利用大规模的生物信息数据,如基因组、转录组和蛋白质组数据,来预测蛋白质的功能。
例如,基于生物大数据技术,可以通过比对已知的蛋白质序列和结构数据库,来预测新的蛋白质结构的功能。
另外,蛋白质结构预测中的计算复杂性也是一个常见挑战。
传统的蛋白质结构预测方法往往需要大量的计算资源和时间,导致预测过程非常耗时。
然而,借助生物大数据技术,可以利用分布式计算和并行处理的方法,加速蛋白质结构预测的计算过程。
例如,利用云计算平台可以将蛋白质结构预测的计算任务分配给多个计算节点,并行处理,从而大幅节省时间和资源。
此外,机器学习算法在蛋白质结构预测中也发挥了重要作用。
生物大数据技术为蛋白质结构预测提供了大量的数据,这些数据可以用于训练机器学习模型。
通过分析和学习这些数据,机器学习模型可以预测新的蛋白质结构。
例如,使用深度学习算法,可以从大规模的蛋白质序列和结构数据中学习到蛋白质的结构特征,并利用这些特征预测新的蛋白质结构。
蛋白质相关错误资源分析及解决策略
蛋白质相关错误资源分析及解决策略关于蛋白质的错误资源分析及解决策略都有助于我们更好地理解和解决蛋白质相关问题。
因此,分析蛋白质资源中存在的错误以及采取解决措施十分重要。
首先,为了分析蛋白质资源中的错误,我们需要将不同的错误进行归纳和整理。
由于蛋白质资源中会出现各种形式的错误,通常可以把这些错误分为结构性错误、技术性错误和信息性错误三大类。
首先,结构性错误是指蛋白质资源的实际数据格式与其声明的数据格式不一致的情况。
其次,技术性错误是指由于数据转换、数据库管理、计算机系统和网络等技术原因导致资源出现损坏、丢失或错误的情况。
最后,信息性错误包括了由于假定前提、记载方式和输入法等原因导致的错误。
有了对蛋白质资源错误的分类,接下来就需要采取相应的解决策略。
针对结构性错误,可以根据所声明的数据格式,进行精确的实际数据检查,如果发现不一致的情况,就应采取措施进行修改。
而与技术性错误有关的问题,可以利用备份及复制的技术,在必要时可以进行数据恢复及系统维护,以保障资源的稳定可靠。
另外,信息性错误也可以通过再次核查和综合分析来确认其真实性,以及采取措施保证资源的准确可靠性。
总之,为了能够有效地分析蛋白质资源中出现的错误,如上文所述,应该首先将不同的错误进行分类,然后根据不同类型的错误选择相应的解决策略,以保证蛋白质资源的准确可靠性。
为了更好地解决蛋白质资源中出现的错误,还可以采取一些其他的措施。
本质上,所有的错误都是由人的操作导致的。
因此,一个关键的解决策略就是加强对相关人员的培训和教育,以保障他们能够正确地进行各种操作,从根本上避免错误产生。
此外,大量的错误还可能来源于数据库管理不善。
这里可以采取自动化的技术,如数据库审计技术,在监控蛋白质资源的存储情况,使得及时发现错误并及时采取补救措施,以保障数据的可靠性。
总之,蛋白质资源中存在的错误可能会对研究造成很大影响,因此,要想有效地解决这些问题,除了采取上述所列出的策略,还可以进一步加强培训、提高数据库管理水平以及采用自动化技术等,以保障蛋白质资源的高质量和准确性。
蛋白系列常见问题及解决方法
蛋白免疫学系列常见问题及解决方法ECL1)、膜上无目的条带a)、目的蛋白未表达:可更换细胞重新表达。
b)、蛋白质被降解:提取蛋白时必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂,抑制蛋白酶活性,并且提取过程应在冰上操作。
c)、转膜过程出现失误。
d)、抗体或酶失活:选择在有效期内的试剂。
e)、抗体不能识别目的蛋白:确认该抗体是否适用于western。
2)、目的条带很弱a)、蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成:可适当加大蛋白上样量。
b)、蛋白没有充分转移到膜上:转膜后可通过预染Marker判断转膜效率,也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶,判断转膜效率。
c)、抗体效价不高,用量不足,孵育时间太短,或抗体反复使用保存不当而失活:可考虑更换效价更高的抗体,或提高抗体稀释度,延长抗体孵育时间;若怀疑抗体失活,可用斑点杂交实验确定抗体活性。
d)、曝光时间太短:可适当延长曝光时间。
3)、目的条带很浓a)、可减少蛋白上样量。
b)、降低一抗二抗稀释度,减少抗体孵育时间。
c)、如果背景深的话,则要把发光液沥干些再压片;如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。
4)、有非特异性条带a)、蛋白上样量过大:降低蛋白上样量。
b)、一抗是多克隆抗体,或一抗、二抗浓度太高:可更换成单克隆抗体,或降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,优化一抗和二抗的使用浓度。
c)、洗膜不充分:可增加洗膜次数和Buffer用量,延长洗膜时间,或在Wash Buffer 中添加终浓度0.05%的Tween-20。
d)、目的蛋白在体内存在多种修饰形式,如乙酰化,甲基化,磷酸化,糖基化等:可查阅文献,用合适的方法去除蛋白的修饰,或选择合适的抗体。
e)、目的蛋白降解:重新准备蛋白样品,并加入足够的蛋白酶抑制剂。
5)、高背景a)、膜没有均匀浸湿:转膜前应用100%甲醇将PVDF膜完全浸湿10秒,快速激活。
b)、膜或缓冲液污染:拿取膜与吸水纸时要戴手套,及时更换新鲜转膜缓冲液。
蛋白质组学研究的完整解决方案
蛋白质组学研究的完整解决方案人体内真正发挥作用的是蛋白质,蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色,随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声,一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕,蛋白质将是今后的重点研究方向之一。
然而,蛋白质的分离和鉴定非常费时,目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具,最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。
据估计,人体内可能有几十万种蛋白质,这大概需要10年时间进行识别。
为了加快蛋白质组学研究进程,以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案,由一系列机械手臂与软件,并结合了二维电泳实验设备与质谱仪,可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。
在Genomic solution值得信赖的技术平台上,你的研究工作将更富成效,重复性更好。
在这一整套Investigator平台上,各仪器之间配合无隙,由于它的整合性及标准性,使得研究进程大大加快,原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。
这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能:2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合,再加上制备好的胶、试剂及附件,使研究工作可以立即展开。
此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。
该系统主要由以下几部分组成:一、2-D电泳系统(Investigator? 2-D Electophoresis System)该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳,设备包括2-D电泳系统所需的各种设备,如pHaser?(IPG胶条电泳)、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。
产品特征:* 提供2D PAGE电泳所需的各种设备,使电泳更加简便,大大节约研究时间* 高分辨率:有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像,有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离* 大容量:可同时容纳15块1mm一维管状胶,或8块2-3mm管状胶;10块IPG胶条和10块二维电泳板胶* 灵活性:该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用* 恒温:高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定,温度变化< 0.5℃* 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统* 提供超纯的相关化学试剂和药品二、蛋白凝胶成像系统(Investigator? ProImage)ProImage专业的蛋白凝胶成像系统提供高灵敏度、高分辨率的大面积蛋白凝胶成像和分析。
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HPLC 篇1 . HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足:解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出:可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配:根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多:调整衰减即可。
检测器时间常数太大:解决办法为降低时间参数检测器池窗污染:解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡:解决办法为排气。
记录仪测压范围不当:调整电压范围即可。
流动相流量不合适:调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线:解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
2 .做 HPLC 分析时,柱压不稳定,原因何在? 如何解决?原因可能有: ?泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;比例阀失效,更换比例阀即可。
泵密封垫损坏,更换密封垫即可。
溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;系统检漏,找出漏点,密封即可。
梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
3 .我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高,请问为什么?柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上,用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子, ( 此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动性 ) 。
这时,如果柱压仍不下降,再检查;更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高,请与厂商联系。
一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题, SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 .液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。
存在干扰峰,解决办法为使用较长柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子。
双向电泳篇1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑 2D 的一向吗?一般情况下是可以的。
但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。
所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面?这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。
为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条。
由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。
如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。
为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量( 80 %满)的矿物油。
3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)?电流的平方和功率成正比。
电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。
当温度超过30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高?刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。
所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的pH 区域移动。
5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动?蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是 pH 指示剂,当它移动到酸性区时( pH4 ),颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值?当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低?当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值,从而变成中性分子。
这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小。
8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生?等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么?硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中性分子。
而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾。
而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集。
10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值?可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。
也可以用体系内已知蛋白来做比对。
11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?横的脱尾可能是: 1 )一向等电聚焦不完全; 2 )某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3 )蛋白的丰度太高。
竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分会影响 2D 胶的效果?核酸,盐,去垢剂等等。
13. 2D 胶的上样量应该在什么范围?上样量和样品有关。
样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。
一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。
14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩?蛋白质的浓缩有很多方法。
大致有超滤法,沉淀法和透析法。
超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。
它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。
另外超滤对样品的要求比较高。
甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。
沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。
缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。
沉淀法中,又以 TCA 法最为普遍使用。
使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。
透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难。
透析法可以和超滤法联用。
先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤。
酶解篇1. 用 Trypsin 酶解蛋白质时,碳酸氢氨的浓度应该是多少?酶解时碳酸氢氨的浓度一般在 10 ~ 50 mM 之间。
碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境,因为 Typsin 的活力在 pH8 ~ 9 之间最高。
最常用的碳酸氢氨浓度有 20 mM ,40 mM 。
盐浓度过大时,后续的冻干过程中会有较多的盐析出;盐浓度过小时,则不能有效的提供碱性 pH 的水解环境(尤其是在样品的 pH 值低,而且体积大时)。
为了确定酶解体系的 pH 值,可以用2. Trypsin 储存液的作用是什么?Trypsin 在 pH8 ~ 9 活力最高,所以为了防止酶的自水解, Trypsin 母液要处于一个酸性的环境里以便长期保存。
Trypsin 储存液的 pH 大约是 5.3 ,是用来稀释母液用的。
如果所需的酶量较大,可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。
如果酶解的样品少,可以用储存液来稀释,这样剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。
3. Roche 的酶和 Promega 的酶,那个更好?Roche 的酶有自降解,而 Promega 的酶基本上没有自降解。
由于酶的自降解峰可以用来做很好的内标,所以一定限度的酶自降解对 MALDI 数据的校准很有帮助。
4. 什么情况下需要用 Ziptip 来处理样品?当样品含有大量的盐时,需要用 Ziptip 来除盐;当样品量很少,但体积比较大时( 20 微升以上)时,需要用 Ziptip 来浓缩。
如果样品中有甘油, SDS ,或其他杂质时, Ziptip 的使用要格外当心,在这种情况下, Ziptip 的填料容易被杂质堵塞;另外 Ziptip 使用不当时,样品会有损失。
所以当样品比较珍贵(的来不易)时,最好先用其他样品做预实验,摸顺条件后,再作真正的样品。
MALDI 篇1. 怎样邮寄我的样品?冻干的胶或干粉可以直接邮寄。
切胶后的湿胶(不用做任何处理),放在 EP 管中 ( 不加任何缓冲液 ) ;用干冰速冻;邮寄时,置样品于足够的干冰中。
液体样品的邮寄方式同湿胶一样。
2. 为什么要使用内标?用内标做校准可以大大减少MALDI-MS 的误差(<70ppm ),从而提高查库结果和可靠性。
好的内标肽段需要有以下的要求:最好有两个肽(两点一线);质量不要在大多数的肽段范围内( 1200 ~ 2500 Da );内标的量要与样品的量成比例;内标对其他肽段离子化的抑止要小。
我们实验室使用的内标是 25fmol 的——和——。
不过,一般情况下,使用外标做校准也可以达到比较满意的数据( <150ppm )。
所以,顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。
3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供 (exact) 对照两块胶?正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。
负对照(空白胶)主要是看样品是否有污染(比如角蛋白的污染);正对照(已知胶,比如同一块胶上的标准蛋白)主要是检测酶解和质谱的效果是否正常。
如果客户不能提供正负对照,我们可以使用自己预先准备的胶条。
如果顾客的样品量大( >10 个 2D 胶上的点),则顾客必须提供正负对照。
4. 对于胶上蛋白质的鉴定,我应该提供多少蛋白质?一般情况下,考染能看得见的点都有机会鉴定出来。
分子量在 2 - 5 万之间的蛋白质,鉴定成功率一般比较大。
分子量小的蛋白酶切位点少,合适的肽段( 1000 ~ 3000 Da )就少,所以鉴定的成功率相对较低。
而分子量太大的蛋白质,在同等质量的情况下,蛋白的摩尔数 (pmol) 较少;而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低(因为整个蛋白质较大),从而影响鉴定的成功率。
5. 为什么我的 MALDI 图谱中都是相差 44Da 的峰,肽段的峰则全被抑制了?相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰,也可能是 polymer ( -CH2CHOH- )峰。