表面分子印迹研究进展

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化学通报２００７年第５期ｈｔｔｐ：Ｉｌｗｍｖ．ｈｘｔｈ．ｏｒｇ表面分子印迹研究进展

仰云峰车爱馥吴健誊徐志康’

（浙江大学高分子系。化学系杭州３１００２７）

摘要为了拓展分子印迹聚合物（ＭｏｌｅｃｕｌａｒｌｙＩｍｐｒｉｎｔｅｄＰｏｌｙｍｅｒｓ，ＭＩＰ）的应用领域，表面分子印迹作为一

种新的方法，受到了极大的关注。本文首先分析了ＭＩＰ传统制备方法存在的问题；然后依据印迹位点所处位

置的不同，分类综述了表面分子印迹的各种方法。

关键词表面分子印迹聚合物膜传感器乳液聚合

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ＭＩＰ的传统制备方法是：将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定配比溶解在溶剂（致孔剂）中，在适当条件下引发聚合后得到块状的高度交联刚性聚合物；然后经粉碎、筛选而得到尺寸符合要求的粒子。此方法所需装置简单，普适性强，但通常存在以下问题：

（１）研磨过程可控性差，不可避免地产生一些不规则粒子，同时破坏部分印迹点。经筛分后获得的合格粒子一般低于制备总量的５０％，造成明显的浪费，尤其对于昂贵的模板分子和功能单体来说，更是难于承受。

（２）由于所制备的是高度交联的聚合物网络，致使其内部模板分子的洗脱比较困难。残留的模板分子在使用过程中发生缓慢脱吸，这将给痕量分析等应用带来较大误差。

（３）印迹位点分布不均一，一部分处于粒子孔壁上，模板分子向其的传质速率较快；而另一些则包埋于聚合物本体之中，受位阻影响，这部分印迹空穴可接近性差，再结合模板分子的速率慢，从而降低了印迹位点的利用率。尤其对生物大分子而言，影响更为严重，所以这种方法不适合对生物大分子进行印迹。

为解决上述问题，表面分子印迹作为一种新的方法应运而生。所谓表面分子印迹，简言之就是采取一定的措施把几乎所有的结合位点局限在具有良好可接近性的表面上，从而有利于模板分子的脱除和再结合，因此该方法尤其适合于对生物大分子的印迹。然而其制备过程远不如传统本体聚合那样来得直接、方便，它需要探索新的适用途径。这方面的研究报道已有不少，但至今尚未形成一个清晰的脉络体系，本文旨在对近年来表面分子印迹的研究进展作一分类总结。

仰云■男，２５岁，博士生，现从事膜表面印迹的研究。

－联系人，Ｅ－ｌｌｋｄｉｌＩ“ｚｋ＠ｚｊｕ．ｅｄｌｌ．ｃｎ

国家自然科学基金资助项目（５０４７３０３８）２００６－１０．１８收稿。２００６．１１－２８接受

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ｈａｐ：／／ｗｗｗ．ｈｘｔｂ．ｏｒｇ化学通报２００７年第５期

１印迹位点处于载体表面ＭＩＰ薄层之中

１．１粒子表面印迹

通过在形状规则的粒子表面形成ＭＩＰ薄层，可制备出高产率、窄分布的复合粒子，该过程无需磨碎和筛分，因此避免了材料的浪费。传统ＭＩＰ粒子制备过程中，粒子的形态结构以及结合位点的识别性能同时受到诸如溶剂、功能单体等因素的影响；而且，欲得到所期望的形态结构所需的条件往往与获得高识别性位点的条件不一致。出于这样的考虑，选择具有合适粒径、孔径及其分布的粒子为载体，制成复合粒子，其形态结构主要取决于载体，由此可以撇开制备条件对形态的影响，而专注于在薄层中形成高质量的结合位点。更重要的是，通过这样的方法，使结合位点处于表面印迹薄层之中，可在较大程度上减少“包埋”现象，提高其可接近性，加速识别的动力学。

Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ等Ⅲ采用光引发聚合技术，将ＭＩＰ薄膜接枝到球形二氧化硅粒子表面。具体分为两步：首先，把偶氮类引发剂通过共价或非共价结合的方式固定到载体粒子表面；其次，将该粒子悬浮于含有印迹分子和单体的溶液中，于１５℃下由ｕＶ光引发聚合。通过调节光强和光照时间，可实现对薄层厚度的控制。所制备的表面印迹粒子尺寸均一，非常适合于填充柱子，充当高效液相色谱（ＨＰＬＣ）和毛细管电色谱的固定相。

此外，核．壳型的ＭＩＰ粒子也被相继制备出来【２。］。Ｃｈａｎｇ等乜１把模板分子雌激素酮（ｅｓｔｒｏｎｅ）经由热可逆共价键连接到功能单体上，通过逐步聚合得到可溶性的聚酰胺酸，然后用传统的聚合物溶液涂层方法，在预先氨基化（提高表面的粘附力）的二氧化硅粒子上引入聚酰胺酸薄层，经过加热处理后，转化为聚酰亚胺。虽然未对聚合物进行交联，但聚酰亚胺分子链之间存在的强相互作用已经足以限制链运动，固定印迹空穴，所以该聚合物显示出良好的印迹效果口１；而且，避免了可控性差的交联反应，使得印迹位点更加均一。透射电镜（ＴＥＭ）测试显示，外壳厚度约为１００ｎｍ，所以有理由相信模板分子向结合位点的扩散将得到改善。ＨＰＬＣ检测发现，相比于雌激素酮的结构类似物而言，此ＭＩＰ复合粒子对雌激素酮具有更长的保留时间，说明其具有高度特异性的识别能力。

上述涂层方法因为芳香族聚酰亚胺分子间的强相互作用而免于交联，所以相对简捷。但是对于一般聚合物，分子间的相互作用不足以保持印迹位点的构象，由此必须对聚合物进行交联，这将使得类似方法过于复杂化而不宜采用。Ｒｉｍｍｅｒ等Ｈ１选择旋光性药物心得安（ｐｒｏｐｒａｎｏｌ０１）为研究对象，利用乳液聚合，从具有表面活性剂性质的单体油酰苯基磷酸氢盐（ｏｌｅｙｌｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＯＰＨＰ）出发合成了表面印迹核一壳粒子，并研究了水相竞争吸附的过程，结果发现该粒子具备了良好的手性拆分能力。但是核．壳乳液聚合法通常存在一个缺点：ＭＩＰ壳层含量不高，粒子结合容量低。如果能够采用纳米尺寸的核，问题将得到解决。为此，Ｍａｙｅｓ等协】选用经典的甲基丙烯酸（ＭＡＡ）和二甲基丙烯酸乙二醇酯（ＥＧＤＭＡ）体系，同样对心得安进行印迹，成功制备了粒径约６０ｎｍ的单分散核一壳纳米粒子。更高的比表面积，将为其在分析方面的应用带来更大的优势。

１．２聚合物膜表面印迹

分子印迹膜结合了膜分离技术便于连续操作、易于放大、能耗低、能量利用率高等优点，因此相比于传统ＭＩＰ微球填充的色谱柱而言，其在亲和分离应用方面更具优势。早期Ｓｈｅａ等№’利用原位聚合法制备了印迹膜，但是存在结合位点可接近性差、过膜通量低等不足，从而限制了该膜的实际应用。

在此基础上，研究人员发展了在多孔支撑膜表面通过接枝或者沉积涂覆ＭＩＰ薄层的新途径。第一个实例来自Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等Ｈ１的报道：以茶碱（ＴＨＯ）为印迹分子，丙烯酸（ＡＡ）为功能单体，亚甲基撑双丙烯酰胺（ＭＢＡＡ）为交联剂，在含有光活性反应基团二乙基二硫代氨基甲酸酯基的相转化膜表面，通过光接枝共聚的方法形成交联聚合物层，其过程如图１所示。通过吸附实验，考察了此ＭＩＰ复合膜在水相中对ＴＢＯ的识别行为，结果发现分离因子ＴＨＯ／。。，高达５．９。

这种方法的不足之处在于：支撑膜材料的制备需要含特殊光敏基团的单体，因而选材范围较窄；反应时间较长（约２４ｈ），而且得到的膜渗透性较低。这些问题限制了该方法的普适性、高效性以及所得膜的实用性。为了克服上述弊端，Ｕｌｂｒｉｃｈｔ等ｎ卅¨在经过通量优化的商业膜表面进行分子印迹修饰，开展

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圈１膜表面光接枝印迹示意图

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了一系列典型的工作。

起先，Ｐｉｌｅｔｓｋｙ等哺’选择聚丙烯（ＰＰ）微滤膜为载体，二苯甲酮（ＢＰ）为夺氢光敏剂，通过ｕＶ光照，生成以共价方式键合于表面的印迹薄层，经测定，干燥状态下其厚度约ｌＯｎｍ。由此可见，支撑体ＰＰ微滤膜的优异渗透性将得以保持。实验结果表明，其水通量为１２０“（ｏ．ｈ），这是迄今为止，印迹膜所具有的最大水通量。快速过滤测试显示，该ＭＩＰ膜实现了对印迹分子的水相识别。

理论上讲，ＢＰ作为一种夺氢光敏剂，适用于任何含ｃ—Ｈ键聚合物膜表面的改性，但对于聚偏氟乙烯（ＰｖＤＦ）膜来说，引发效率却比较低。为此，Ｐｉｌｅｔｓｋｙ等【９１采用经聚丙烯酸酯类表面亲水化改性的ＰＶＤＦ微滤膜作为支撑膜来进行表面印迹，接枝效率得以提高。最终制得的ＭＩＰ复合膜能够有效地对印迹分子实行选择性固相萃取（ＳＰＥ）。

此后Ｕｌｂｒｉｃｈｔ等¨０’…进一步尝试在未经亲水化预处理的ＰＶＤＦ微滤膜表面进行印迹改性。鉴于ＰＶＤＦ的相对惰性，ｇ．断裂型的光引发剂安息香乙醚（ＢＥＥ）被涂覆于膜表面，ＵＶ照射将其断裂为自由基，进而引发聚合。在这过程中，膜表面对光引发剂产生的自由基保持惰性，即膜并未参与化学反应，由此可以认为ＭＩＰ薄层仅是“沉积”在膜表面，而非通过共价键相连。另有文献表明，这样的薄层在膜上是稳定削１２】。相比而言，该方法应用范围更为普遍。原则上，任何膜材料都可以应用这种方法进行表面修饰。此外，Ｈａｒｔ等ｎ２１报道了利用光引发油包水乳液聚合在多孔ＰＰ膜表面沉积ＭＩＰ薄层的新方法。所制备的印迹复合膜可用于水环境，且具有很高的稳定性，在保存６个月后其选择性不变。

１．３传感器电极表面印迹

ＭＩＰ的一个重要应用是在生物传感器中取代生物分子作为识别元件，研制耐受性强、成本低的分子印迹仿生传感器。由于信号转换器只能感知其表面超薄范围内待测分子与识别元件结合而产生的物理或化学信号，所以ＭＩＰ通常被制成超薄膜，通过适当方式固定在其表面。以下，将根据信号转换器作分类介绍。

１．３．１电容性传感器Ｍｉｒｓｋｙ等Ｈ３１采用电聚合法，在金电极表面合成了苯丙氨酸（ｐｈｅｎｙｌａｌａｍｉｎｅ，Ｖｈｅ）的印迹聚苯酚层。理论计算得知，该ＭＩＰ膜厚度仅约１６ｎｍ。为了改善电极涂层的绝缘性能，作者采取了如下改进措施：聚合前，由巯基苯酚在电极表面自组装成单分子层，以此改善ＭＩＰ层与金表面的结合力；聚合后，用巯基烷烃填补聚合物的缺陷。阻抗谱研究确认，经印迹后电极电容行为占支配地位，可与甘汞电极（ＳＣＥ）组成测定Ｐｈｅ的电容性传感器。实验结果发现，吸附Ｐｈｅ所引起的电容变化比其它几种参比氨基酸大得多，而且变化量与Ｐｈｅ的浓度基本成线性关系，线性范围为０．５—８ｍｓ／ｍＬ，响应时间约１５ｍｉｎ。经优化处理，此传感器可应用于对模板分子浓度的监测。但需要指出的是，该ＭＩＰ层交联度低，导致稳定性、重复利用性都较差，基本上只能满足一次性使用。为此，Ｄｅｌａｎｅｙ等¨引通过光引发接枝共聚，在电容信号转换器表面制备了高度交联的ＭＩＰ薄膜。研究发现，较之前者，传感器的响应重复性和可逆性得到明显提高。

１．３．２石英晶体微天平（ＱＣＭ）传感器ＱＣＭ能够探测表面的质量变化，并作出基于谐振频率移动的响应，通过监测频率变化即可以测定表面的吸附质量。它拥有纳克水平的灵敏度，因此被广泛地用作分析领域传感器的转换器，与ＭＩＰ结合，构成能够检测特定分子的ＭＩＰ－ＱＣＭ传感器。

ｈｔｔｐ：ｌｌｗＷｗ．５ｘｔｂ．ｏｒｇ化学通报２００７年第５期

Ｅｂａｒｖｉａ等ｎ列分两步制得了基于ＭＩＰ的ＱＣＭ传感器：第一步，以咖啡因（ｃａｆｆｅｉｎｅ）为模板分子，采用传统本体聚合法，合成了基于甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯的微米级ＭＩＰ粉末；第二步，把该粉末和聚氯乙烯的悬浮液滴到石英晶体的电极表面，经旋涂使之均匀分布，待溶剂挥发完全即可。由于采用的是微米粒子，印迹点可接近性受限，这将影响响应时间。实验结果显示，频率变化达到稳定需要时间长达ｌＯｍｉｎ。

为提高响应速度，可把ＭＩＰ薄膜粘结于电极表面。制备这样的薄膜，一般做法为：将含分子印迹各所需组分的溶液旋涂到ＱＣＭ薄片上，然后实行光引发原位聚合。应用上述方法，Ｄｉｅｋｅｒｔ等口副制备了对烟草花叶病毒（’ｒＭＶ）进行印迹的传感器。研究发现，它能对烟草花叶提取液中的ＴＭＶ发生特异性响应，且速度加快。

到目前为止，虽然ＭＩＰ．ＱＣＭ传感器取得了一定的进展，然而响应速度慢；低浓度下灵敏度不足以及ＭＩＰ薄膜在水溶液中容易从金属表面脱落等问题依然困扰着人们。Ｒｏｔｅｌｌｏ等¨＂在ＭＩＰ中引入１，５．双（２一乙酰氨基丙烯酰氧基）戊烷（１，５－ｈｉｓ（２．ａｃｅｔｙｌ．ａｎｔｉｎｏａｃｒｙｔｏｙｌｏｘｙ）ｐｅｎｔａｎｅ），结构如图式１所示，极大地提高了薄膜在金表面的粘附力。另外，一定量单官能度的类交联剂结构单体的加入，能在一定程度上降低交联密度，致使传质速率加快，响应时间缩短。大致１０ｓ的响应时间，为原位、实时监控物质浓度提供了可能。实验结果还表明，该传感器具有相当高的灵敏度，检测限达到１０。１２ｍｏｌ／Ｌ。

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图式１Ｉ．５－双（２一乙酰氨基丙烯酰氧基｝戊垸的化学绪构

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为了更大程度地提高薄膜的稳定性ｎ８’１９］，也有研究者采取共价键合的方式把薄膜固定到转换器表面。其中，Ｔａｋｅｕｃｈｉ等ｎ耵在经过烯丙基硫醇修饰而引入双键的金表面实施原位聚合，达到了共价连接的目的。

１．３．３其它类型传感器Ｋｕｂｏ等啪１在金电极表面研制了以除草剂阿特拉津（ａｔｒａｚｉｎｅ）为模板的ＭＩＰ电化学传感器。其测量原理是：当阿特拉津结合到ＭＩＰ时发生电化学反应，致使阳极电流增大；通过测定电流大小，即可对浓度进行定量，其检测溶液线性范围是１．１０ｔｔｍｏｌ／Ｌ。Ｔｕｒｎｅｒ等乜¨通过在表面等离子谐振（ＳＰＲ）转换器上原位嫁接约４０ｎｍ（由原子力显微镜（ＡＦＭ）测得）的超薄聚合物层，制备了ＭＩＰ．ＳＰＲ传感器，收到了良好的效果。其余未提及的部分类型传感器列于表１。

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２印迹位点严格处于ＭＩＰ材料表面．

在上述载体表面所制备的ＭＩＰ薄层中的印迹位点，有相当一部分还是处于高度交联的聚合物本体之中而非表面。但是由于这样的薄层只有数十纳米的厚度，所以其中印迹位点的可接近性和利用率得到了大幅提高。由此可见，此处所谓的表面印迹之“表面”仅指ＭＩＰ薄层处于载体表面，为了达到在严格意义上把所有结合位点限定在ＭＩＰ材料表面的目的，研究人员发展了一系列更加合适的表面印迹途径。

化学通报２００７年第５期ｈｔｔｐ：１１ｗＨｒｗ．ｈｘｔｂ．ｏｒｇ

２．１固定模板分子后印迹

Ｒａｔｎｅｒ等∞３首先报道了利用二糖分子对生物大分子蛋白质进行表面印迹的工作。其制备过程如下：通过物理吸附，将蛋白质固定到云母片表面，再将一层二糖溶液旋涂在吸附的蛋白质上。一经干燥，该糖层便通过大量的氢键与蛋白质络合。然后将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过射频辉光放电等离子体处理与糖分子交联而沉积。最后剥去云母片，洗脱蛋白质，即会在含氟聚合物表面的二糖层中留下与印迹蛋白互补的识别位点。考虑到只存在于二维表面上的结合位点少，导致ＭＩＰ层的结合容量较小，因此需要采用高灵敏度的放射性同位素标记结合分析法来考察印迹效果。结果发现，对某一蛋白印迹的材料，对单一蛋白（无论是印迹蛋白还是非印迹蛋白）的吸附都表现出相同的结合量。一般认为，这主要是多肽链上众多的功能基团导致了对蛋白吸附的非特异性所致。然而，在对混合蛋白质进行竞争吸附时发现，ＭＩＰ却表现出对印迹蛋白的选择性结合。鉴于此，作者认为：在竞争吸附过程中，蛋白质之间存在互相交换，亲和力较大的印迹蛋白将逐步取代亲和力较小的其它蛋白与印迹位点结合，由此显示了良好的识别效果。该报道也是迄今为止，对水溶性生物大分子表面印迹比较成功的一个例子，为后续研究提供了新的思路。

与物理吸附不同，Ｍｏｓｂａｃｈ等ｍ１把模板分子茶碱（ＴＨＯ）经化学键固定到多孔硅胶的孔表面。然后把单体混合液填充入孔，使功能单体与固定于孔壁的ＴＨＯ形成络合物。聚合后，再用氟化氢水溶液把连有ＴＨＯ的硅胶载体溶解除去，最终得到ＭＩＰ微球，该过程如图２所示。

圈２茶碱固定于硅胶印迹的示意图

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由于结合位点都严格位于孔表面，其可接近性必将得到大幅提高，从而加速模板分子的再结合；再者模板分子的化学键合固定可以防止其在预聚单体混合物中聚集，从而改善印迹位点的识别性能。此外，Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ等汹３也做了类似的研究，并用荧光标记的小分子表征了表面结合位点良好的可接近性。受此启发，最近Ｙａｎｇ等ｍ１进一步开展了在纳米线状聚合物表面进行印迹的工作。其主要步骤是：经溶胶一凝胶模板合成，在纳米孔铝膜内壁上形成硅纳米管；再将模板分子固定在硅纳米管内壁上；接着将单体混合液导入纳米管，引发交联聚合；最后，除去载体，获得表面含有印迹位点的单分散性纳米线。静态吸附实验发现，印迹效果明显。而且，纳米线的高比表面积将在很大程度上提高表面印迹聚合物的结合容量。

２．２采用乳液聚合印迹

Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ等ｂ¨较早报道了利用乳液聚合来制备表面印迹亚微米颗粒的新方法。其过程如下：首先把印迹分子胆固醇（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ０１）和一部分功能单体二乙烯基苯（ＤＶＢ）用末端连有硫酸根的十二碳疏水长链进行化学修饰，使其具有表面活性剂的性质。然后把前两者与聚苯乙烯核一起加入水相中进行乳化。结果，ＤＶＢ聚集在核周围，而经改性的ＤＶＢ（主要起乳化稳定作用）和印迹分子处于两相界面上，其中疏水端浸没在ＤＶＢ中，硫酸根则伸入水相。最后实施乳液聚合，待洗脱模板分子后，就在颗粒表面形成了胆固醇的疏水空穴，见图３。为了验证表面印迹位点的再结合能力，采用两端接有胆固醇的聚乙二醇链对印迹颗粒进行了絮凝实验，结果发现粒子尺寸增大，絮凝发生，表明该疏水空穴确实被局限在表面上，且容易接近。

与此同时，Ｇｏｔｏ等ｍ１对核苷（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）进行印迹，选择含有两个疏水长链的季铵盐为功能分子，利用乳液聚合法合成了ＭＩＰ粒子。功能分子经乳化稳定，能够立于交联单体相和水相的界面上。由此，水相的核苷能与处于界面的铵盐正离子通过静电相互作用形成复合物，而最终的交联聚合将功能分子

化学通报２００７年第５期

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圈３乳液聚合恻备胆固醇印迹纳米球

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固定在粒子表面，也即固定了识别位点在表面。此后，他们［３３１选用既有结合能力又起乳化稳定作用的双功能分子进一步发展了以上的研究。

２．３其它方法

Ｓｈｉｎｋａｉ等Ⅲ１发展了一种基于侧链带有硼酸基的聚Ｌ一赖氨酸的构象转变的表面印迹方法。模板分子单糖能够与聚合物链上的硼酸基发生相互作用，诱导高分子链发生构象转变。然后把结合了单糖分子的聚合物链通过侧链巯基与金的相互作用，固定到ＱＣＭ金电极表面，随即有利于对模板单糖进行识别的多肽链新构象也被固定下来，整个过程如图４所示。实验结果表明，该ＱＣＭ传感器能够较好地响应单糖模板分子的再结合。

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３结束语

表面分子印迹通过把结合位点统一建立在具有良好可接近性的表面上，来解决由传统本体聚合所获褥的ＭＩＰ粒子当中结合位点不均一、可接近性差、识别动力学慢等一系列问题。目前表面印迹技术的研究还处于起步阶段，存在问题有：对表面印迹点可接近性的相关表征较少，因而无法有力地评价该技术所得ＭＩＰ在结合速度上的优越性；表面印迹聚合物由于维度上的缺失（三维变成二维）致使结合容量下降；此外暴露于二维表面的印迹点相对于三维网络中的印迹点而言，结构稳定性可能较差，从而导致可重复使用次数下降。但是上述各类方法经进一步发展，仍将可能为实现从小分子到生物大分子（比如蛋白质、核酸）乃至整个细胞的印迹提供可借鉴的有力手段。

?３３０?化学通报２００７年第５期

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