生物化学与分子生物学-第六章第二节 维生素DKE

摄入不足
➢佝偻病 ➢软骨症
摄入过量
➢高钙血症、高钙尿 症 ➢高血压
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2. 维生素E
来源：膳食摄入(植物油和绿叶蔬菜)
维生素E
生理作用：
过氧化自由基
多不饱和脂肪酸
链式反应
抗衰老、抗肿瘤、保护肝脏，促进受损细胞恢复
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代谢 • 氧化作用
α-生育酚 过氧自由基α-生育酚醌（随尿排除）；5,6-环氧 - α-生育酚醌；2,3环氧- α-生育酚醌
均加入2mmol/L乙酸铵及0.1%甲酸 • 梯度洗脱程序：0~4.5minA%为27%，
4.5min~6.2min为2%，6.2min后回到初始比例保 持至程序结束。
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• 多反应监测模式 （multiple reaction monitoring, MRM）
✓ 在单反应监测(single reaction monitoring, SRM) 技术的基础上演化而来的。
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• 我国人体营养评价生化指标：25(OH)D2和 25(OH)D3
• 正常参考值 ➢ 我国：25(OH)D2、25(OH)D3分别为 36~150nmol/L, 50~100nmol/L
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正常生理功能
➢促进钙、磷吸收 ➢促进骨细胞形成和 骨的钙化 ➢维持儿童及成人骨 骼健康 ➢减小自体免疫疾病、 肿瘤及心血管疾病。
联质谱法：
金标准
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（一）高效液相色谱-二级质谱法测定血清中 25(OH)D3、25(OH)D2
➢ 原理：血清经甲醇沉淀母蛋离白子，进正行己二次烷裂萃解取,
产生子离子，根据子
25(OH)D3、25(OH)D2 ，离定高子量效碎分液片析相进行色定谱性分和离，四 级杆串联质谱检测，保留时间及特征离子对定 性，氘代内标法定量。
C3-差向异构
肾脏
肾脏
1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2
C3-差向异构
3-epi-1,25(OH)2D3 3-epi-1,25(OH)2D2
代 衰谢期产4~物8小多时，，25血(O清H前)D者生含物量半明衰显期高15于~2后0天者，，1因,2此5(O25H(O)2HD)半D 更适合作为评价人体维生素D是否缺乏的指标。
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2. 样品处理 750µL血清→加入溶于甲醇-异丙醇混合溶
剂的内标d6-25(OH)D3→750µL正己烷→离心 →取正己烷层→挥干溶剂→甲醇-水溶液复溶 后测定
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3. 仪器参考条件
• 色谱柱 C18柱（2.1mm×50mm，2.5µm） • 流动相 甲醇（B%）-水（A%）两相流动相中
✓ 原理：首先要能够检测到具有特异性的母离子，然 后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导 (collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰， 只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。
✓ 三重四级杆质谱(triple quadrupole system, TQS) 是进行单一质荷比扫描最灵敏的质谱系统
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经小肠吸收， 与蛋白结合， 经血液循环， 部分分布到 脂肪和肌肉 组织，部分 在肝肾中代 谢
• 维生素D代谢(P75)
3-epi-25(OH)D3 3-epi-25(OH)D2
肝脏
维生素D3、维生素D2
C3-差向异构
25(OH)D3、25(OH)D2
24R,25(OH)2D3
24R,25(OH)2D2
R1 R2
有荧光：λ ex=298nm， λ em=325nm
有荧光
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VK1（叶绿醌类） 无荧光
VK2（甲基萘醌类） 无荧光
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二、代谢和生物监测指标
1. 维生素D：
• 来源：膳食摄入和体内合成 膳食摄入：动物性食品 体内合成：2条途径
紫外线
胆固醇→7-脱氢胆固醇→维生素D3
紫外线
植物中麦角固醇→维生素D2
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进入质谱的离子
四级杆协同作用模式：多反应监测模式 Q1第一根四级杆；Q2：碰撞池；Q3：第二跟四级杆；检测器
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• 检测离子对（母离子/子离子）： 25(OH)D3为 （401.35/159.10），d6-25(OH)D3 （ 407.35/159.10）， 25(OH)D2 （413.35/83.10）
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4. 注意事项
（1）标准溶液同样需用紫外分光光度法标定。 （2）该方法无法区分3-epi-25(OH)D和25(OH)D。 但3-epi-25(OH)D含量低，对结果影响小。来源：膳食和肠道细菌合成
正常生理功能 ➢促进凝血（Vk为谷氨酸羧化酶的辅酶，将凝血酶原 前体蛋白转变为凝血酶原） ➢促进骨钙蛋白γ-羧化，从 而结合Ca2+
缺乏症
➢凝血时间延长 或出血
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监测指标：凝血酶原前体蛋白和骨钙蛋白 的未羧化率。
• Vk含量极低（100~4000pg/mL）， 作为人体 Vk营养状况评价指标有困难。且二者之间的 关系有待证实。Vk原型不适宜作为常规Vk营 养状况评价指标
D3(胆钙化醇cholecalciferol)
生育酚和生育三烯酚，各 无氧时对热稳定；对碱、紫外线、
有αβγδ4种异构体，α-生 铁盐不稳定；极易被氧化，保护其
育酚活性最强
他物质不被氧化
维生 自然存在的VK1和VK2 素K
耐酸热，易被光和碱分解
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HO
Vitamin D2
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Cholecalciferol
• 非氧化作用 Ve 细胞色素P450 2-（2’羧乙基）-羟基苯二氢吡喃； α-2-（4’-羧基-4’-甲丁基）羟基苯并二氢吡喃（随 尿排出）
尿中代谢产物多，但与Ve营养状况关系不确定
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• 评价指标：血清或全血Ve含量。测定方法 不区分异构体，结果为Ve的总量，以α-生 育酚作为标准物质定量
第二节 维生素D、E、K
理化特性 代谢和生物监测指标 样品的采集和保存
测定
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一、理化特性
1. 共性
脂溶性维生素，难溶于水，易溶于脂肪及乙 醇、丙酮、乙醚等有机溶剂
2. 个性
存在形式
理化性质
维生 素D
维生 素E
维生素D2(麦角钙化醇， 对热氧碱稳定；光照和酸性环境缓 ergrocalciferol)和维生素 慢异构；过量辐射生成有毒化合物
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三、样品的采集和保存 常规采集静脉血，采集时间可根据采 集目的调整
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四、血清中Vd的检测
不能区分25(OH)D3和
蛋白竞争结合法
25(OH)D2，易受其他代
放射免疫法
谢产物影响，结果偏高
10%~20%
高效液相色谱-紫外检 同时检测Vd多种代谢
测器法
产物 ，Vd2含量低，不
高效液相色谱-二级串 易检出