国家科技支撑计划重点项目疫苗关键生产技术研究开发课题申报指引

③多糖-蛋白结合疫苗：高分子量结合物含量≥75%～80%；纯化回收率≥35%～50%；结合物原液中游离蛋白含量低于总蛋白的5%；Hib纯化多糖的内毒素含量稳定在不高于10EU/ug多糖。提高稳定性，降低多糖和结合蛋白的解离和降解，2年有效期内疫苗游离多糖含量不高于15%，游离蛋白含量不高于5%；
④建立稳定、敏感、快速的游离多糖和蛋白质监测方法。按照国家标准制备出有关的标准参考物质（检定用标准菌株、细胞株，多糖、蛋白以及标准参考血清），抗体含量和抗体功能活性检测方法建立并能够标准化；
（2）细菌多糖蛋白质结合疫苗质量标准研究。主要包括多价结合疫苗和多联多价联合疫苗质量标准确立（多价疫苗中各种单价疫苗抗原含量检测，游离蛋白、游离多糖含量检测、多种抗原成分剂量、配伍研究，以及最低免疫剂量的确定等）。
（3）载体蛋白多样化研究。开发TT和DT以外的新载体蛋白质；对现有载体蛋白使用风险的评价，以及对新的载体进行安全性、有效性的全面评价研究，完成H21G、64K外膜蛋白、C5a肽酶等新型载体蛋白的特性研究；以及探索这些新型载体蛋白与细菌多糖结合的方法或工艺。
（2）细胞病毒批次培养规模：生物反应器体积≥30升，力争使部分疫苗产品生产能力达到100升的规模。
（3）培养细胞密度≥1×107cells/ml；工作体积的微载体≥20g/l；培养病毒滴度不低于旋转培养技术。
（4）病毒感染后，细胞培养维持时间应≥20天，并能多次收获病毒；溶细胞性病毒除外。
（5）病毒滴度均高于《药典—三部》中规定的各种疫苗原液的标准。
建立高效的疫苗抗原表达技术体系，包括普通抗原、结构复杂疫苗抗原等在内的抗原表达研究开发。利用基因工程技术构建重组疫苗抗原、新型载体蛋白用于结合疫苗；以中国绿脓杆菌优势感染毒株为亲本株构建系列脱毒的疫苗抗原组分，研制更为安全、有效的外毒素疫苗或有效的抗原载体；通过基因改造，建立汉逊酵母高效表达技术平台，并构建汉逊酵母表达人乳头瘤病毒疫苗；解决用一次性反应器系统培养昆虫细胞高效表达HPV疫苗的所有关键技术，建立通用的、实验条件达到规模化水平的细胞培养技术平台和疫苗生产工艺平台；应用基因工程构建呼吸道合胞病毒（RSV）G、F亚单位疫苗抗原等。
（4）细菌多糖蛋白质结合疫苗效果评价方法建立。包括：
①标准参考物质的制备；
②抗体含量检测方法建立与标准化；
③抗体功能活性检测方法建立与标准化。
2
(1)技术指标
①建立600～1200升发酵罐的高密度发酵技术，使每批培养物获得的Hib粗多糖达到1000克以上，Hib纯化多糖达到60克以上；
②提高累计收率达到投入Hib多糖的12%以上；结合物原液及疫苗成品中游离多糖含量稳定在不高于10%；优化后的衍生、结合工艺使结合物中多糖的收率达到投入多糖的40%；
3
本课题拟安排国拨经费520万元，要求申报单位自筹经费不低于520万元。
课题3
1、研究内容
利用基因工程技术改造菌毒种，筛选具有我国自主知识产权的高表达工程菌毒种, 建立汉逊酵母表达质粒和酵母工程细胞，以及酵母汉逊或毕赤酵母表达系统；提高现有重组疫苗工程菌毒种的表达量，以及改造抗原表达产物的形式；应用于构建高效的工程菌毒种表达乙型肝炎病毒亚单位疫苗抗原等，提高免疫原性，探索培养液的国产化，实现高密度发酵与高表达技术。
附件2.
“十一五”国家科技支撑计划重点项目“疫苗关键
生产技术研究开发”课题申报指南
一、总体目标
本项目的总体目标是着力解决制约我国疫苗产业发展的关键生产技术，完善或建立疫苗关键性技术平台，发挥其示范作用，使我国疫苗大品种生产关键技术水平迈上新台阶，大幅度缩小与发达国家之间的差距。通过项目实施，提高紧缺疫苗大品种的产量，提高优势企业疫苗的质量，为疫苗行业的进一步集约化提供科技支撑；大力推动国际化进程，促进我国疫苗产品出口，提高我国疫苗产品在国际市场的占有率。
(3)加速和推进其它细菌多糖蛋白质结合疫苗研究开发中起到示范作用，如9价肺炎结合疫苗和4价流脑结合疫苗、伤寒Vi-rEPA结合疫苗、甲型副伤寒结合疫苗、痢疾结合疫苗，大肠杆菌结合疫苗等，力争1～2种产品获临床研究批件、2种产品完成临床试验或取得新药证书。
3、经费预算
本课题拟安排国拨经费1040万元，要求申报单位自筹经费不低于1040万元。
建立高滴度病毒的增殖培养方法，确定最优的细胞与病毒培养方法及培养条件。研究多种病毒在生物反应器中的生长特点。
2
（1）研究成果示范于其它大品种疫苗的生产和研究开发；着重应用于脊髓灰质炎病毒、乙脑灭活疫苗、狂犬病、风疹（2BS等二倍体细胞）、轮状病毒（vero）、水痘等多种病毒性疫苗的技术升级或产品开发。
通过项目的实施，建立3-5个技术平台，突破5-10项关键技术，力争1-2个品种获得临床研究批件、2-3个品种获准换发生产文号，大幅度提高8-10种疫苗产品的产量，实现我国疫苗产业年销售收入新增8-10亿元。
二、实施年限
项目实施年限为2008年7月～2010年12月。
三、主要内容
课题1
1
（1）研究多糖－蛋白质结合化学的适宜方法。利用具有代表性的Hib结合疫苗优化制备条件和结合物大规模纯化技术条件；优化Hib多糖衍生及多糖蛋白结合技术；解决Hib多糖活化、衍生，与载体蛋白结合过程中的条件优化，进行规模纯化层析条件的优化，最终使多糖-蛋白结合疫苗的产量提高，结合物原液质量指标稳定；建立Hib结合物原液、成品中结合物含量、成品中游离蛋白、游离多糖的快速、稳定的测定方法游离蛋白质和游离多糖含量的质量控制方法。
课题2
1
规模化病毒与细胞培养技术研究。研究开发生物反应器微载体技术，进行哺乳类细胞规模化培养，大规模培养疫苗病毒。对于不适宜微载体培养技术或悬浮培养的细胞，则采用其它规模化培养技术。同时，兼顾具有我国自主知识产权的新型细胞基质的开发和研究。
细胞在生物反应器中培养特性的研究；细胞培养条件的研究，包括对溶氧、培养基成分、细胞代谢产物、生物反应器中微环境等对细胞生长的影响；不同细胞微载体的筛选对比研究。微载体与细胞相互影响因素的研究；建立生产规模的逐级放大方法，以达到百升以上规模；生物反应器的操控对细胞培养的影响。
⑤探索基于高效液相色谱的游离蛋白、游离多糖测定方法，探索基于高效液相色谱的Hib多糖分子大小测定以及Hib多糖-蛋白结合物分子大小的检测方法，提高结合疫苗质量控制的水平；
⑥使我国的Hib结合疫苗的安全性和免疫原性与国家先百度文库水平的同类产品具有可比性，且免疫后抗体GMC水平较高。
(2)经济指标
Hib疫苗产品的生产能力达到1000万剂量；销售量增加到600万剂量。