蛋白指纹图谱技术及检测报告解读ppt课件
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蛋白质印迹课件
常用的固定化膜： NC膜（硝酸纤维素膜）和 PVDF膜。
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
蛋白质测序ppt课件.ppt
出了890C, 890M.型.
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
每次测定的样品用量从最初的250nmol到二十世纪九十年 代只需几十pmol左右。仪器工作的基本原理主要经过以下 几步： (1) 将待测的蛋白质加入到仪器的旋转杯中。 (2) 在一定的条件下进行Edman降解, 经偶联－裂解－获得 ATZ氨基酸。 (3) 旋转杯一边旋转，一边抽真空，除去Edman降解时残 留的溶剂后, 降解的蛋白质和从蛋白质N末端断裂下来的 ATZ—氨基酸形成薄膜, 贴在旋转杯内壁上。 (4) 从蛋白质N—末端断裂下来的ATZ—氨基酸经氯丁烷 抽提出来。
(1)
高负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
将PTH-氨基酸, 通过高效薄层层析(如聚酰胺薄膜层析)分离, 每一种
PTH—氨基酸在一定的展层剂的条件下，其迁移率是一定的，在薄
膜上的坐标的位置就可以确定。然后与标准的PTH—氨基酸在薄膜
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
1.2蛋白质序列测定的重要意义 蛋白质序列测定主要可以提供以下几种参数:
(1) 为DNA 序列分析找出探针， (2) 作为蛋白质和肽类纯度鉴定 (3) 研究蛋白质的结构及功能之间的关系及蛋白质结构的 同源性。 (4) 确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点 (5) 确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点 (5) 可以科学的解释蛋白质晶体结构, 蛋白质分子进化的分 支点, 分子遗传疾病发病机理，分子免疫的机理。
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
指纹图谱(PPT)
分布：主产云南文山、砚山、马关等地，广西 靖西、百色以及广东部分地区有产。
1年生
2年生
3年生
4年生
5年生
6年生
三七主根
其中云南省文山州占80%以上， 种植面积约5万亩，分布于文山 砚山、马关、麻栗坡、西畴等
三七药材资源分布图
三七GAP种植基地
化学成分研究：
已分离成分： 人参皂苷（ginsenoside）-Rb1、Rd、Re、
HO
O glc
20(S) 20( R)
notoginsenoside 8 notoginsenoside 9
glcO OH
OOH
HO
Oglc
notoginsenoside R10
HO
O glcO
OH
Oglc
glcO OH
notoginsenoside R1
OCH3
HO
HO Oglc
notoginsenoside R12
第三部分、三七系列中药注射剂指纹图谱研究及 相似度计算软件的试用。
研究单位：
中国药科大学 中国药品与生物制品检定所 中科院昆明植物研究所 广西药品检验所 上海市药品检验所 云南省药品检验所 广东省药品检验所 黑龙江省药品检验所 北京禾普康天然药物技术开发有限公司
研究的主要内容
➢ 三七药材GAP情况 ➢ 指纹图谱方法学研究 ➢ 三七药材指纹图谱研究、三七总皂甙生
500 400 300 200 100
0 0
10
20
mAU 500
VWD1
A,
(SANQI\A2112502.D)
Wavelength=203
nm
400
300
200
1年生
2年生
3年生
4年生
5年生
6年生
三七主根
其中云南省文山州占80%以上， 种植面积约5万亩，分布于文山 砚山、马关、麻栗坡、西畴等
三七药材资源分布图
三七GAP种植基地
化学成分研究：
已分离成分： 人参皂苷（ginsenoside）-Rb1、Rd、Re、
HO
O glc
20(S) 20( R)
notoginsenoside 8 notoginsenoside 9
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notoginsenoside R10
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OCH3
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notoginsenoside R12
第三部分、三七系列中药注射剂指纹图谱研究及 相似度计算软件的试用。
研究单位：
中国药科大学 中国药品与生物制品检定所 中科院昆明植物研究所 广西药品检验所 上海市药品检验所 云南省药品检验所 广东省药品检验所 黑龙江省药品检验所 北京禾普康天然药物技术开发有限公司
研究的主要内容
➢ 三七药材GAP情况 ➢ 指纹图谱方法学研究 ➢ 三七药材指纹图谱研究、三七总皂甙生
500 400 300 200 100
0 0
10
20
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VWD1
A,
(SANQI\A2112502.D)
Wavelength=203
nm
400
300
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蛋白质指纹图谱技术-标准化与重复性
-
---- Vacuum ---Accelerating Potential
7.5 5 2.5 0 6 4 2
2000
Spectra View
4730.4+H
4000
4618.2+H 2185.8+H 5045.2+H 2781.9+H 3915.2+H 2528.2+H 4000.2+H 2369.9+H3172.3+H 4345.6+H
遗传算法结合支持向量机模型（SUM）
联合学和优化方法学数据逻辑分析（LAD）策略
浙江大学肿瘤研究所： 蛋白质谱数据分子平台（ZUCI-PDAS）
相关系数： 使几个高表达的蛋白峰的强度和解析度都在 可接受范围内，以比较实验的重复性（试剂、 操作、仪器的稳定性）。
受众多因素的影响
标准化
实验条件 实验过程（样本处理、芯片结合、芯片检测） 操作 仪器和芯片 分析方法和软件 质量控制
四、重复性与标准化
生物化学芯片流程图
蛋白质芯片 抗体固定 抗体芯片 单克隆抗体
抗原捕捉
抗原抗体复合体 清 洗 结合能量吸附物质
用SELDI检测捕获的抗原
四、重复性与标准化 （一）实验条件
待测样本来源广 样品用量极少 超高的检测灵敏度，可快速获取实验结果 可用于低丰度、小分子量蛋白质的发现 可发现与疾病相关蛋白，提供疾病诊断的最佳组合指标 可进行小型实验或高通量检测自由选择
二、应用范围
生物标志物的发现
肿瘤蛋白标志物：肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、
大肠癌、乳腺癌、卵巢癌等
蛋白指纹图谱技术及检测报告解读ppt课件
抗体组—质谱仪检测解决假阴性问题
发光 放射 1 5 10 15 （+） （+） 荧光 酶标
1
5
10
（-） （+）
填补国际空白
IF 9.9 MCP
Xu Y, Liu JD, Li N. A novel assay for prognostic biomarker of gastric cancer with lymph node metastases. Molecular & Cellular Proteomics. 2006, 5: 357.
什么是蛋白指纹图谱技术
蛋白指纹图谱技术不同于只能单一指标分析的传统肿瘤标 志物，通过对蛋白质动态、全景的分析，将病人疾病早期最 微小基因表达产物（蛋白质或多肽）系统地分析，获得待检 标本中各种蛋白的含量和蛋白质分子量等信息，绘制成蛋白 指纹图谱，通过计算机软件与正常人、亚健康状态人群、良 性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照，比较分析差异，就能 快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。
检测的特异性和敏感性高
中华检验医学杂志; 2004，27：706-709
7
为何需要蛋白指纹图谱技术检测?
目前肿瘤检测项目： 2、基因检测（肿瘤超早期筛查）
Genomics 基因组学
DNA:
What could happen 可能发生
mRNA: What might happen 可以发生 Proteomics Proteins: What is actually happening 蛋白质组学 实际正在发生
蛋白指纹图谱技术及检测报告解 读
蛋白质组学-蛋白指纹图谱
蛋白质的分离技术
蛋白指纹图谱蛋白芯片技术检测诊断早期胃癌的临床意义
ｔ ｃ ｏｏ ｙ ｉ ａ ｔｉ ａ ｅ ，ｏ ｓ ｒ ｅ ｉｍａ ｋ ｒｃ ｎ ｄａｅ ｔ ｕｉ ｄｉｇ ｏ ｔ ｄ ｌ ｎ ｏ ｅ ａ ｕ ｔ ｔ ｌｎｃ ｌ ｅ ｈｎ ｌ ｇ ｎ ｇ ｓｒｃ ｃ ｎｃ ｒ ｔ ｃ ｅ ｎ ｂ ｏ ｒ ｅ ａ ｄｉ ｔ ｓ，ｏ ｂ ｌ ｄ ａ ｎ ｓｉ ｍｏ ｅ ｓａ ｄ ｔ ｖ ｌ ａｅ ｉｓｃ ｉ ｉａ ｃ
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蛋白质检测方法ppt课件
移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选
择性识别
26
精品课件
✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
曙红Y
23
铬天青S
精品课件
溴酚蓝
Evans blue
24
四羧基苯基卟啉
精品课件
偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
25
精品课件
✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转
17
精品课件
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
12
精品课件
比色法-BCA法
肺结核蛋白指纹图谱诊断技术研究
翁丽珍 ， 王 琳 ， 学玲 ， 李 黄明翔 ， 郭巧玲 ， 方素 芳 ， 张丽 水 ， 陈晓 红 ， 郑晓 虎 ， 刘坦 业
摘 要 ： 目的 探 索应 用 蛋 白质 组 学技 术 于 肺 结 核诊 断。 方法 从 本 院 临床 肺 结 核 病 例 中， 择 痰 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 培 选 养阳性、 阴性 肺 结 核 患 者共 １ ０名 ， ３ 以健康 者 ６ ５名 为对 照 ， 行 血 清 蛋 白指 纹 图谱 检 测 ， 析 其 相 关 蛋 白峰 值 并 进 行 统计 学处 进 分
ｍ／ ｚ ７例 ，１０ ｚ６ ， ８ ． （５ ６ ） １７０ｍ／ 例 占 ４ ６ ５ ／ ５ 。结 论 血 清 蛋 白质 指 纹 图谱 技 术 简便 、 快速 ， 本 用 量少 ， 筛选 结 核 病 特 异 性 标 是
标 志 物 的有 效 手 段 ， 望 成 为 活 动性 肺 结 核 的早 期 辅 助 诊 断指 标 。 有 关 键 词 ： 枝 杆 菌 ； 核 ； 白指纹 图谱 技 术 ；实验 室诊 断技 术 ； 分 结 蛋 免疫 组 质 谱 ； 清 诊 断 血
ｔ ｃ ｎｏ ｏ ｙ． ｅ ｈ ｌ ｇ Ａ ａ ｐｌ ｆ１３ ｐ ｕ — ａ ｔ ｒｏｌｇｉａｌ ｏｓｔｖ ｎｄ ｎｅ ｔｖ ｔｅ ｔ ｉｈ ａ ｔｖ １ ｏｎ ｒ ｕ ｒ ｕ１ｓｓ ａ ｄ ６ ｓ ｍ ｅ ｏ ０ ｓ ｕｔ ｍ ｂ ｃ ｅ ｉ ｏ ｃ ｌｙ ｐ ｉｉｅ ａ ｇａ ｉｅ ｐａ ｉｎ ｓｗ ｔ ｃ ｉｅ ｐｕｍ ａ ｙ ｔ ｂｅ ｃ ｏ ｉ ｎ ５
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摘 要 ： 目的 探 索应 用 蛋 白质 组 学技 术 于 肺 结 核诊 断。 方法 从 本 院 临床 肺 结 核 病 例 中， 择 痰 检 测 结 核 分 枝 杆 菌 培 选 养阳性、 阴性 肺 结 核 患 者共 １ ０名 ， ３ 以健康 者 ６ ５名 为对 照 ， 行 血 清 蛋 白指 纹 图谱 检 测 ， 析 其 相 关 蛋 白峰 值 并 进 行 统计 学处 进 分
ｍ／ ｚ ７例 ，１０ ｚ６ ， ８ ． （５ ６ ） １７０ｍ／ 例 占 ４ ６ ５ ／ ５ 。结 论 血 清 蛋 白质 指 纹 图谱 技 术 简便 、 快速 ， 本 用 量少 ， 筛选 结 核 病 特 异 性 标 是
标 志 物 的有 效 手 段 ， 望 成 为 活 动性 肺 结 核 的早 期 辅 助 诊 断指 标 。 有 关 键 词 ： 枝 杆 菌 ； 核 ； 白指纹 图谱 技 术 ；实验 室诊 断技 术 ； 分 结 蛋 免疫 组 质 谱 ； 清 诊 断 血
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蛋白质免疫印迹技术(共62张PPT)
制备。
一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良 好，而且能够提供足够数量的血清。
（三）抗原
抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、 类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免
疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、 立体结构等。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
1）菠萝蛋白酶以0.
半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。
（二）用于免疫的动物
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免 疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。
功能名称 生理功能 病理表现 取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。
2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；
完全佐剂。
每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，制备血
一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良 好，而且能够提供足够数量的血清。
（三）抗原
抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、 类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免
疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、 立体结构等。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
1）菠萝蛋白酶以0.
半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。
（二）用于免疫的动物
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免 疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。
功能名称 生理功能 病理表现 取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。
2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；
完全佐剂。
每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，制备血
蛋白指纹图谱(共24张PPT)
真正做到肿瘤早期预警
• 科学研究证明，从一个肿瘤细胞的形成，到病理切片下看见肿瘤细胞
需要10至15年时间。尽管目前有巴氏涂片、隐血试验、食道拉网、计
算机断层扫描、超声诊断等很多早期筛查方法，但敏感性和特异性平
均不到60％。据美国权威杂志《肿瘤研究》报道，蛋白指纹图谱 技术可以测出前列腺癌形成5年前的蛋白指纹。因为蛋白指纹图
• 目前，我国每年癌症发病人数约为160万。面对癌症我们真的就 束手无策了吗？长期以来，我们已经习惯了“生病就医”的医
疗模式，在没有出现疾病症状前对自己的健康状况不予重视。 可怕的癌症并不是不可治愈的，关键是发现的时间。据世界卫
生组织最近的统计数据表明，癌症患者若能早期发现，治愈率 可达80～90％。由于没有早期发现，我国每年死于癌症的病例数约 130 万。癌症早期常常没有特异症状，那怎样才能做得到早期发现？
• 检测过程毫无痛苦。传统的肿瘤诊断检测多半会很痛 苦，许多病人都难以忍受，而蛋白指纹图谱检测技术 只需您3毫升的血，就能全方位地了解您的疾病信息， 方便快捷，整个过程大大地减轻了您的痛苦。
• 准确率高，特异性高。蛋白指纹图谱技 术打破传统肿瘤标志物检测观念，用多 肿瘤特异性蛋白组成一个常规肿瘤标志 物，提高了准确率，且特异性可到达８ ０％以上。
• 蛋白指纹图谱技术是联合应用蛋白芯片、磁性微球两项新的
蛋白分离技术和生物质谱技术来检测人类不同生理或疾病状 态时蛋白质组动态特征，是21世纪肿瘤早期检测的革命性技 术，荣获了2002年诺贝尔化学奖，在肿瘤的筛查、疗效判断、 预后评估和健康状态评估方面广泛应用。
•
以卵巢癌为例，运用蛋白指纹图谱技术对来自正常、早期
• 持续性消化不良、便血、血尿
哪些人群适合做蛋白指纹图谱肿瘤检测？
蛋白质印迹分析课件
2. 蛋白樣品處於 pH6.8 壓縮膠的上層，pH8.8 的分 離膠層在下層。由於pH不連續和膠孔徑大小不連 續，在濃縮膠運動中，Pro-受阻小，不同的蛋白 質可被濃縮到分離膠的上成層，使全部蛋白質處 於同一起跑線上；當蛋白質進入分離膠時 ，不同 蛋白因分子篩效應和電荷效應而出現遷移率的差 異， 最終達到彼此分開 。
四、酶標免疫反應顯示 Immuno-detection of Protein Blots with HRP-
labeled Antibody
1. 蛋白轉移膜的麗春紅染色顯示（本次實驗不做此步）
轉移電泳完畢，斷電，取出轉移夾，取出轉印膜於20ml蒸 餾水中漂洗一遍，然後用10ml麗春紅染液（0.2%麗春紅-1% 乙酸）染1min；用蒸餾水漂洗至背景近白色，漂洗應少量 多次，每次30ml左右；照相留底；繼續用蒸餾水漂洗至色 帶消失或者基本消失。
轉膜
硝酸纖 維素膜
價格便宜
簡單快速封閉非特異性抗體結合
膜的選擇
封閉非特異性抗體結合麻煩
尼龍膜
價格昂貴
需要更高的蛋白結合率
（尼龍膜： 480µg/cm2 ；硝酸纖維素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的選擇 目的蛋白與硝酸纖維膜的結合能力弱
需要更大的機械強度
2. 電流 1mA-2mA/cm2，通常 200mA/膜，按照 目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間。
提取組織或細胞蛋白，測得含量
基
製備SDS-PAGE膠
本
蛋白樣品變性、電泳
操
作
電泳轉膜
流
程
封閉，一抗過夜
清洗，二抗結合
清洗，底物顯色，曝光、顯影， 結果分析
實驗操作
一、小鼠血清製備 （Preparation of Mouse Serum）（已準備好）
蛋白质指纹图谱技术探究
蛋白质指纹图谱技术探究1蛋白质组学研究方法目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中已经得到越来越多的应用。
在蛋白质组学中以下三项技术的进步对于实验诊断与临床医学研究进展将具有决定性的影响2~5。
11蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。
第一,通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物;第二,通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。
其中主要的技术有双向电泳(two-dmiensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)、毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)、亲和层析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmi-croarray)、磁性微球(magneticbeads)和免疫组等。
特别是蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白质指纹图谱技术克服了以往技术的缺点,具有高灵敏度、高通量、结果重复性好(CV<5~10%)、可机械化操作和方法灵活等特点。
待测样品来源广泛,不需作特殊前处理,可以直接点样检测,如血清、尿液及组织液等;检测快速,一般一例标本的检测时间仅需约5min,从标本制备到出结果全过程仅约1h。
蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白质指纹图谱技术有可能在体液中潜在肿瘤标志(tumormarker)检测方面创造革命性突破。
12生物质谱(biologicalmassspectrometry)技术生物质谱是化学领域中非常重要的一种分析方法。
它通过测定分子质量和相应的离子电荷实现对样品中分子的分析。
19世纪末科学家已经奠定了这种方法的基础,1912年科学家第一次利用它获得对分子的分析结果。
在质谱分析领域,已经出现了几项诺贝尔奖成果,其中包括氢同位素氘的发现(1934年诺贝尔化学奖成果)和碳60的发现(1996年诺贝尔化学奖成果)。
蛋白质检测方法 ppt课件
蛋白质检测研究进展
Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
✓ 优点：准确性高，灵敏度高，与传统的生物学技术手 段相比, 基于质谱的蛋白质组学技术更适合于临床疾病 的研究
✓ 缺点：技术发展不够完善
毛细管凝胶电泳法
✓ 原理：电泳也称作电迁移，是指溶液中带电粒子在电场中 所发生的迁移运动，运动的迁移率与组分分子的大小、极性、 亲和能力、等电点、相分配系数以及所带电荷的多少等多个 因素有关。毛细管电泳又称为毛细管电分离，是以毛细管为 分离通道、以高压直流电场为驱动力、根据带电粒子迁移率 的不同来实现组分分，小鸟说早早早……”
蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具 有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的 自身独有特点与性质： 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸 反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α羧基反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
曙红Y
铬天青S
溴酚蓝 Evans blue
四羧基苯基卟啉
偶氮染料
Contents
1、蛋白质简介 2、蛋白质的检测方法 3、蛋白质与疾病的关系
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
✓ 优点：准确性高，灵敏度高，与传统的生物学技术手 段相比, 基于质谱的蛋白质组学技术更适合于临床疾病 的研究
✓ 缺点：技术发展不够完善
毛细管凝胶电泳法
✓ 原理：电泳也称作电迁移，是指溶液中带电粒子在电场中 所发生的迁移运动，运动的迁移率与组分分子的大小、极性、 亲和能力、等电点、相分配系数以及所带电荷的多少等多个 因素有关。毛细管电泳又称为毛细管电分离，是以毛细管为 分离通道、以高压直流电场为驱动力、根据带电粒子迁移率 的不同来实现组分分，小鸟说早早早……”
蛋白质简介
蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其 主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约 7%）、S（约 0~3%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具 有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的 自身独有特点与性质： 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩 脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸 反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α-氨基及α羧基反应、） 蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关
曙红Y
铬天青S
溴酚蓝 Evans blue
四羧基苯基卟啉
偶氮染料
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抗体组—质谱仪检测解决假阴性问题
1
5
10
15
（+） （+）
发光 放射 荧光 酶标
1510（-）源自填补国际空白（+）
IF 9.9 MCP
Xu Y, Liu JD, Li N. A novel assay for prognostic biomarker of gastric cancer with lymph node metastases. Molecular & Cellular Proteomics. 2006, 5: 357.
蛋白质组学-蛋白指纹图谱
蛋白质的分离技术
磁性微球（Magnetic Beads）
质谱技术
基质辅助激光解吸附质谱技术 (MALDI-TOF-MS)
表面增强激光解吸/电离飞行时间 质谱（SELDI-TOF-MS）
•蛋白指纹图谱仪的原理是利用激光脉冲辐射使 芯池中的分析物解析形成荷电离子，跟据不同质 荷比这些离子在仪器场中飞行的时间长短不一， 由此绘制出一张质谱图案。 •其阅读器的准确率为氢原子的十分之一，这表 明蛋白指纹图谱仪使医院进入原子级别的诊断世 纪。 •将一个人的测定图谱与正常人或疾病蛋白指纹 图谱库中某种疾病（如肿瘤、老年性痴呆等）的 图谱相对照，就能知道这个人的图谱是正常或是 患有某种疾病（如肿瘤）。
5000
15 10
5 0 155000 10 5 0
55 00 0000
5200
5400
5335.3+H
5200 55 22 0000
5400 5335.7+H
55 44 0000
5600 A
5600
normal
5566 00 00
10000
6 4 2 0
10000 6 4 2 0
110000 00 00
基因检测——是对未来 患上疾病的一个风险评 估
蛋白质检测——可对各 期型包括正在发生的疾 病做出评估诊断
——医院应用的案例
蛋白指纹图谱检测报告实例分析
体检人A所得蛋白指纹图谱经疾病数据库分析后生成以下报告单
蛋白指纹图谱检测报告实例分析
根据体检人A报告单得到以下信息 1、图谱信息（图谱分析软件中可索引得到）
为何需要医用质谱（蛋白指 纹图谱仪）
为何需要蛋白指纹图谱技术检测?
目前肿瘤检测项目： 1、传统肿瘤标志物检测（肿瘤十二项、肿瘤八项）
优点：采用较成熟的双抗夹心化学发光检测法
不足：假阴性检双抗夹心法的假阴性问题：双抗体夹心法,属于非竞争 结合测定,它是检测抗原最常用的方法(生化占90%),适用于检测分子中 具有至少两个抗原决定簇,如丢失一个抗原决定簇,会产生假阴性.
3、已是癌症患者。 如果检查出该肿瘤标记峰阳性，且表达量高，可通过影像学或内镜等临 床检查寻找到肿块的位置，争取尽早治疗。
4、癌症复发。 曾患癌症的患者，如血液中发现既往的肿瘤标记峰呈阳性，预示可能有 癌症复发迹象。
14
蛋白指纹图谱检测阴性意义
1、本次检测没有直接发现与肿瘤相关的标记峰，预示肿瘤相关疾病近期存在的可能性较低。 但并不代表以后就没有患肿瘤可能。为保持久的健康，定期的早期肿瘤筛查复检是必 要的，推荐1年进行一次筛检。
11000
11000 111100 00 00
12000
11683.5+H
12000 11683.6+H
112200 00 00
13000 A
13000
normal
1133 00 0000
2、标记峰信息
蛋白指纹图谱检测报告实例分析
根据所得信息对照疾病标记峰数据库进行健康提示
A体检人胸片信息
正常人胸片信息
什么是蛋白指纹图谱技术
蛋白指纹图谱技术不同于只能单一指标分析的传统肿瘤标 志物，通过对蛋白质动态、全景的分析，将病人疾病早期最 微小基因表达产物（蛋白质或多肽）系统地分析，获得待检 标本中各种蛋白的含量和蛋白质分子量等信息，绘制成蛋白 指纹图谱，通过计算机软件与正常人、亚健康状态人群、良 性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照，比较分析差异，就能 快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。
15
Thank you!
后经参考其他临床检测手段，最终确诊A体检人患有肺肿瘤
蛋白指纹疾病标记峰
蛋白指纹图谱检测阳性意义
1、非肿瘤病变影响 同一肿瘤标记峰一项偏高，根据健康提示进行其他检查除外该部位其他 疾病影响。
2、癌症潜伏期或癌前病变状态。 同一肿瘤标记峰两项或两项以上偏高，经临床进一步检查未发现肿块， 说明机体存在恶性细胞或炎症反应，预示的可能是癌症前期，或超早期 癌症状态。
2、首次检测有单一标记峰阳性，复查没有再发现该类型阳性，同时也没发现有其它新标记 峰阳性，说明血液中疾病蛋白含量表达降低或消失。如此，可以初步判断该标记峰蛋 白是一种超早期发现的蛋白类型，预示目前采取的干预措施有效。
3、由于目前人类肿瘤相关蛋白组还在发掘中，我们所检测的肿瘤疾病蛋白峰是目前我们疾 病数据库及国内外文献报道过的与肿瘤密切相关的蛋白峰，但并未涵盖100%的肿瘤相 关蛋白，因此可能会有15%左右的假阴性可能。我们会不断把最新发现的相关蛋白加入 检测中。