【酶工程】酶分子侧链基团的化学修饰
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的基本性质
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点【摘要】酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。
但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。
对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。
简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。
1 酶的化学修饰的基本原理酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。
前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性．催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。
1. 1功能基团的修饰酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(～COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。
脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。
这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。
1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。
表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶解度和分散度。
第四章酶工程 酶的化学修饰_提纲_2016
4.3.1 几种重要的修饰反应 （1） 酰基化反应
（2）烷基化反应
（3）氧化和还原反应
（4）芳香环取代反应 4.3.2 酶分子侧链基团的化学修饰举例 1、巯基的化学修饰
4
2、咪唑基的化学修饰
5
3、酚羟基的化学修饰
4、胍基的化学修饰
6
5、色氨酸吲哚基的化学修饰 6、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰
7
聚乙二醇： 聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容性，在体内不残留，无 毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。 活化方法：三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法 三氯均嗪法是一个常用的方法。 三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代
右旋糖酐： 右旋糖酐是由 α-葡萄糖经 α-1, 6 糖苷键形成的多糖，有较好的水溶性及 生物相容性，可用作代血浆。 右旋糖酐链上的相邻双羟基结构经活化后可与酶上的自由氨基相结合。 溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下 活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应，共价结合。 技术要点：
1
造。
化学修饰过程中需考虑的因素 ¾ 对酶性质的了解：活性部位，稳定条件，侧链基团性质，酶反应最适条 件等； ¾ 对修饰剂的要求：分子量，水溶性，活性基团，活化方式，活化条件， 修饰后酶活性的半衰期； ¾ 对反应条件的选择：分子比例，反应条件（反应温度、pH、时间、溶剂 性质、离子强度等）
4.2.2 化学修饰的方法学 1、 修饰反应专一性的控制 （1）试剂的选择：修饰目的；反应生成物容易定量测定；试剂大小
研究酶分子的解离-缔合现象 推算出酶分子大小、形态及构象变化 测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态
12
利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离 2、确定氨基酸残基的功能 e.g. 在丙酮酸激酶的精氨酸残基的修饰反应过程中，伴随着精氨酸残基的修 饰，酶分子可逆地失活，底物保护作用说明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的 磷酸结合位点具有一个必需的精氨酸残基 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶的化学修饰PPT课件
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（一）酶的表面修饰
1.1 化学固定化： 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残
基将酶共价连接到惰性载体上。
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1.2 酶的小分子化学修饰作用
小分子化合物对酶活性部位或以外的侧链基团 进行化学修饰，常用修饰剂有氨基葡萄糖、 醋酸酐等。
通过两个途径实现 化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的 种类少。 蛋白质工程：利用基因操纵技术。
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2.3 肽链伸展后的修饰
❖ 脲、盐酸胍处理使酶肽链充分伸展，修饰酶， 然后复性（具有某种催化活性的构象）。 Saraswothi等，先让酶变性，然后加入 相应于所希望酶活力的竞争性抑制剂，待获 得所希望酶的构象时，用戊二醛交联，以固 定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。以 丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一 种“酸性酯酶”。
二、 酶修饰的方向
❖ 1． 核酸水平（生物酶工程的内容）
通过基因工程方法改变编码酶分子的基 因而达到改造酶的目的。
❖ 2． 蛋白质水平（化学修饰、定点突变 等）
通过分子修饰的方法来改变已分离出来 的天然酶的活性。
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酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
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④ 催化基团（部位）是在催化反应中直 接参与电子接受关系的部位。
牛 胰 凝 乳 蛋 白 酶 Ser195 ， His57 ， ASP120
枯草杆菌蛋白酶，Ser221, His64, ASP32
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⑤ 底物结合部位：酶活性部位直接与其 底物结合的残基构成的空间部位。
酶分子侧链基团修饰1
侧链基团修饰 side residues modification
采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发 生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的 结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需 基团时经常采用。
氨基
巯基 吲哚基 酚基
羧基
胍基
ห้องสมุดไป่ตู้
咪唑基
谢谢
常见基团的化学修饰反应：氨基
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常见基团的化学修饰反应：羧基
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常见基团的化学修饰反应：巯基
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常见基团的化学修饰反应：胍基
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常见基团的化学修饰反应：酚羟基
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常见基团的化学修饰反应：咪唑基
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常见基团的化学修饰反应：吲哚基
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作用
增加稳定性
提高酶活性 降低抗原性 引起酶催化活性、功能的改变 获得自然界原来不存在的新酶种
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残 基上的功能团，包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚 基、咪唑基、吲哚基等。
维持酶活 性中心应 有空间构 象所必须 基团
与底物相结 影响底物中某些化 合，使底物 学键的稳定，催化 与酶的一定 底物发生化学反应 构象形成复 并将其转化成产物。 合物
酶工程学第九周分子修饰
烷基化试剂
可被修饰的氨基 酸残基侧链
R ——X： 2，4——二硝基氟苯，DNFB
多肽序列分析法：Sanger N-端序列分析法，1945年
Na2S4O6：连四硫酸钠
四硝基甲烷
二硫二硝基苯甲酸
4，4’－二硫二吡啶 对氯汞苯甲酸 2－氯汞－4－硝基苯酚 N-乙基马来酰亚胺 过氧化氢氧化
氨基的化学修饰
3.通过修饰降低或消除酶的抗原性
当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中就 可能出现与此外源蛋白特异性结合的物质，这些物质称为抗体， 能引起体内产生抗体的物质称为抗原。
大分子化学修饰是降低甚至消除酶抗原性的有效方法之一
猪肝尿酸酶用白蛋白修饰: 最适pH由天然酶的10.5,下降到7.4—8.5
举例：超氧化物岐化酶（SOD）
O2- + O2- + 2H+ =H2O 2 +O2 SOD作用：保护DNA，蛋白质和细胞膜
SOD药用：类风湿性关节炎，白内障，膀胱炎，皮肤炎，红斑 狼疮等。
SOD静脉注射：t1/2=6~30min 右旋糖酐-SOD：t1/2=7h 聚乙二醇-SOD：t1/2=35h
三、修饰方法
修饰酶
四、大分子化学修饰的优点
1.通过修饰提高酶的活性
核糖核酸酶 Vs 右旋糖酐修饰核糖核酸酶
1
： 2.25
胰凝乳蛋白酶 Vs 右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶
1
： 5.1
2.通过修饰增强酶的稳定性
酶的半衰期t1/2：酶的活力降低到原来活力一半时所经过 的时间。
很多修饰剂分子具有多个活性基团，常与酶形成多点交 联，使酶的空间结构稳定，特别是使酶活性中心的构象得到保 护。
乙酸酐 2’4’6－三硝基苯酚 2’4－二硝基氟苯 碘代乙酸 还原烷基化
酶工程考试题目
酶工程考试复习资料一、名词解释（3×5=15分）（注意：回答一为课本上的原话，回答二为老师PPT上的内容，回答三为百度搜索结果，大家根据自己的情况选择适合自己的答案，避免雷同）1.化学酶工程:化学酶工程也可称为初级酶工程，酶工程主要采用两种方法。
一是化学酶工程，即通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶；另一种是生物酶工程，即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而声查性能稳定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。
因此酶工程可以说是把酶学基本原理与化学工程技术及重组技术有机结合而形成的新型应用技术。
2.酶的光学异构专一性回答一：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的一个。
回答二：只作用于具有不对称碳原子造成的镜像异构体（光学异构体）中的1种。
3.酶的活性中心回答一：在构成酶分子的氨基酸残基中只有少数的氨基酸残基与酶的催化活性相关，通常将这些氨基酸集中的、与酶的活性相关的区域称为酶的活性中心。
回答二：酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中心回答三：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域4.酶催化的邻近效应回答一：所谓邻近效应，就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。
回答二：底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，从而使反应速率大大增加。
回答三：邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应5.盐析法回答一：利用无机盐破坏蛋白质分子的水化层，中和表面的电荷，使之聚集形成更大的分子团而沉淀。
回答二：根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。
回答三：盐析法是指在目标溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。
酶的化学修饰
酶的化学修饰
聂继龙
酶化学修饰的概念：通过主链的 切割剪接和侧链基团的化学修饰 对蛋白酶进行分子改造，以改变 其理化性质及生物活性。这种用 化学方法对酶分子施行种种手术 的方法称为“酶分子的化学修 饰”。
广义上讲:凡涉及共价键或部分共价 键的形成或破坏的转变都可以看作 是酶的化学修饰。从狭义上讲：酶 的化学修饰在较温和的条件下，以 可控制的方式使一种酶同某些化学 试剂起特异反应，从而引起单个氨 基酸残基或其功能基团发生共价的 化学修饰。
7、对组织分布能力的改变 一些酶经化学修士后，对组织的 分布能力有所改变能在血液中被 靶器官选择性的吸收
酶化学修饰的应用 （1）酶结构与功能的研究 可以通过修饰剂对酶的作用，以及 修饰的部位来判断酶的结构 (2）在医学方面的应用，主要是治 疗和诊断方面的应用。 （3）在工业方面的应用 主要是提高产量，减少成本，而且 将少对环境的污染。
5、肽链的延伸：为了有效的修 饰酶分子的内部区域，可以先用 脲或盐酸胍处理，使酶分子的肽 链充分伸展，这就提供了化学修 饰酶分子内部疏水基团的可能性。 然后让修饰酶的伸展肽链在适当 条件下，重新折叠成某种具有催 化活力的酶。
通过定点突变的化学修饰。通过 一些可控制的方法在酶或蛋白质 特殊的位点引入特定分子来修饰 酶或蛋白质，结合定点突变引入 一种非天然氨基酸侧链来进行化 学修饰，从而得到一些新颖的酶 制剂。
酶的化学修饰的目的：人为的改变 天然酶的一些性质，创造天然酶不 具有的某些优良性质甚至创造新的 活性，来扩大酶的应用领域促进生 物技术的发展。概括起来有三点：1、 提高生物活性。2、增强不良环境中 的稳定性。3、针对特异反应，降低 生物识别能力。
化学修饰的方法： 1，酶的表面修饰，（1）大分子修 饰，可溶性大分子，如聚乙二醇， 聚乙烯比咯烷酮，聚丙烯酰胺、葡 聚糖、环糊精、肝素等。一般聚乙 二醇的分子量在500~2000应用最 广。聚乙二醇是两亲性分子，化学 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇。
化学酶工程幻灯片(1)
（一）概 述 一． 酶的化学修饰原因
1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。（热、蛋白） 2． 作用的最适条件不符。（半衰期延长，最适PH扩大） 3． 酶的主要动力学性质的不适应。（Km增大，结合差） 4． 临床应用的特殊要求。 (异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性）
中含有金属离子的酶
31
举例
将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换 成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若 将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型 蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。
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（三） 修饰酶的性质及特点
一．热稳定性 二．抗原性 三．体内半衰期 四．最适pH 五．酶学性质的改变 六．对组织的分布能力变化
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1. 酶分子侧链基团的化学修饰
一．几种重要的修饰反应 二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 三. 研究新热点
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一．几种重要的修饰反应 1．酰化及其相关反应
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2．烷基化反应
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3．氧化和还原反应
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4．芳香环取代反应
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二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
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1．巯基的化学修饰
抗体酶的制备
将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修 饰法等途径。
诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆 抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。
拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设 计的。
引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入 到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。
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（四） 酶化学修饰的应用
一．化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用
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酶工程复习整理
酶⼯程复习整理酶⼯程复习整理酶⼯程的概念：酶⼯程⼜称酶技术，是酶的⽣产与应⽤的技术过程，其主要任务是通过⼈⼯操作，获得⼈们所需的酶，并通过各种⽅法使酶发挥其催化功能。
酶⼯程的发展阶段：1.从动物、植物或微⽣物细胞和组织中提取酶，加以利⽤的阶段 2,发酵法⽣产，揭开近代酶⼯业的序幕。
酶催化作⽤的机制：邻近效应；底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同⼀分⼦，从⽽使反应速率⼤⼤增加。
定向效应：酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向产⽣的效应。
底物的形变(distortion)和诱导契合(induced fit)：酶中某些基团或离⼦可以使底物分⼦产⽣“电⼦张⼒”，底物分⼦发⽣形变，接近过渡态，降低了反应活化能。
酸碱催化(acid-base catalysis)：通过瞬时向反应物提供质⼦或从反应物接受质⼦以稳定过渡态，加速反应的⼀类催化机制。
共价催化(covalent catalysis)：⼜称亲核催化(nucleophilic catalysis)或亲电⼦催化(electrophonic catalysis)。
亲核催化剂(亲电⼦催化剂)能放出电⼦(汲取电⼦)并作⽤于底物的缺电⼦中⼼(负电中⼼)，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能。
⾦属离⼦催化：（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆改变⾦属离⼦的氧化态调节氧化还原应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。
活性部位微环境的影响酶催化反应的特点a.催化剂的特性：⽤量少⽽催化效率⾼；不改变化学反应的平衡点；参与反应，但在反应前后本⾝⽆变化b.酶催化的特性：1.⾼效性（原因）a.酶可极⼤程度上降低反应所需的活化能b.酶催化是多种催化因素的协同作⽤（邻近效应、定向效应，扭曲变形和构象变化的催化效应，⼴义的酸碱催化、共价催化及酶活性中⼼微环境）2.专⼀性3.反应条件温和4.酶的活性是受调节控制的专⼀性的分类：绝对专⼀性结构专⼀性族的专⼀性酶的专⼀性键的专⼀性光学异构专⼀性⽴体化学专⼀性⼏何异构专⼀性光学异构专⼀性：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的⼀个。
酶蛋白分子侧链的修饰
酶蛋白分子侧链的修饰摘要：用化学修饰的方法研究酶分子结构与功能已经成为一种重要的基础手段，酶分子侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的，这是酶分子化学基础研究的一个方向。
蛋白质侧链上的功能基主要有：氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍基、甲硫基等。
根据化学修饰剂与酶分子之间反应的性质不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。
1.几中重要的修饰反应1.1酰化及其相关反应这类化学修饰剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，它们在室温（20~25℃）、PH值为4.5~9.0的条件下可与酶分子的某些侧链基团发生酰基化反应。
被作用的酶分子侧链基团有氨基、羟基、巯基及酚基等。
1.2烷基化反应这类试剂的特点常常是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致酶分子的亲核基团（例如—NH2，—SH等）发生烷基化。
属于这类修饰试剂的有2,4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等。
被作用的分子的侧链基团有氨基、巯基、羧基、硫醚基和咪唑基等。
1.3氧化和还原反应这类试剂具有氧化性，能将侧链基团氧化，属于这类试剂的有H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺等，有些试剂具有很强的氧化性，往往容易使肽链断裂，因此在修饰反应中要控制好氧化条件。
光敏剂存在下的光氧化是一种比较温和的氧化作用。
易受氧化作用的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。
另外还有一类主要作用于二硫键的还原剂。
这类修饰剂有2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇（DTT）等。
值得提出的是连四硫酸钠或连四硫酸钾是一种温和的氧化剂，因此在化学修饰反应中常用来作为—SH的可逆保护剂。
1.4芳香环取代反应酶分子氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。
这类修饰反应的一个典型的例子是四硝基甲烷（TNM），它可以作用于酪氨酸的酚羟基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物。
酶工程复习整理
固定化的方法有哪些
1．载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。
根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。
A．物理吸附：作用力：氢键、范德华力、疏水键等。吸附剂包括无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）和有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。
b.序列随机机制：两种底物不按一定的顺序结合，产物的释放也是随机的。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。
乒乓机制：酶首先和一个底物结合，释放出一个产物以后，再与另一个底物结合，并释放出产物，不形成三元配合物。转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制
酶抑制作用的类型：
A.可逆抑制作用（reversible inhibition）：抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。
几何异构专一性：酶能识别顺反异构体。
键专一性：酶只要求作用于一定的键，对键两端的基团无要求。
基团专一性(族专一性)：除了对键要求以外，还要求键一侧的基团为特定的基团。
绝对专一性：对唯一的底物催化唯一的反应。
酶活性中心的构成：
酶的活性中心(active center)：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域。包括结合部位Binding site：酶分子中与底物结合的部位或区域（结合部位决定酶的专一性）以及活性中心－催化部位catalytic site：酶分子中促使底物发生化学变化的部位（催化部位决定酶所催化反应的性质。）
Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）：既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应后在抑制剂分子上产生活性基团，再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。专一性高
酶的分子修饰
铜
细胞色素氧化酶的辅酶
钴
维生素B12的组分
锌
脱氢酶类，DNA聚合酶，碳酸酐酶的辅因子
锰
精氨酸酶和其他酶的辅因子
钼
黄嘌呤氧化酶的辅因子
镍
脲酶的辅因子
钒
硝酸还原酶的辅因子
• 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶 往往会丧失其催化活性。如果从新加入原 有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或 者部分恢复。
与酶分子的某一特定部分（通常是酶的活性部位） 有特异的亲和力，可以与这个特殊部位结合而进行 酶分子修饰的试剂称为亲和标记试剂，通常采用酶 的底物类似物作为亲和标记试剂。
亲和标记试剂的特点
• 在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复合物
• 亲和试剂的修饰程度是有限的
• 竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率
氧基，即单甲氧基聚乙二醇（MPEG）
MPEG可以采用不同的试剂进行活化，制成可以在 不同条件下对酶分子上不同基团进行修饰的聚乙二 醇衍生物。用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物 有：
• 聚乙二醇均三嗪衍生物 • 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 • 聚乙二醇马来酸酐衍生物 • 聚乙二醇胺类衍生物
酶分子的大分子结合修饰的作用：
• 有些含有金属离子的酶，该金属离子往往是酶活 性中心的组成部分，对酶的催化功能起重要作用。 如：过氧化氢酶中的Fe2+
• 用于修饰酶分子的金属离子通常是二价金属离子。 如：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+， Fe2+等。
金属离子
元素
碘 硒 铁
主要生物化学功能
甲状腺激素结构中需要 谷胱甘肽过氧化物酶和其他酶类的辅因子 血红素酶（过氧化氢酶，细胞色素氧化酶）的辅基
酶分子化学修饰(1)
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（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 1 概念 •定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链 上特定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有： 氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链 易被修饰，它们一般具有亲核性。
（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶
分子共价结合。
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3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
为修饰剂）。
（与前面化学蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种：
1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化 部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行， 称肽链有限水解。
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但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
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（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
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4．咪唑基的化学修饰
常用修饰剂：碘乙酸、 焦碳酸二乙酯等； 其中焦碳酸二乙酯在近 中性的条件下对组氨酸 残基上的咪唑基具有较 好的特异修饰能力，而 且产物在240 nm波长处 有最大吸收峰，可以通 过修饰得知分子中咪唑 基的数量。
5. 胍基的化学修饰 来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨 基酰基化。 修饰剂：
丁二酮
几种重要的修饰反应
1．烷基化反应
2．酰化及其相关反应
3．氧化和还原反应
4．芳香环取代反应
• 重要的修饰反应*
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应
• 特定氨基酸残基侧链基团的 化学修饰*
巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
酶分子侧链基团的化学修饰
• 一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 • 二．几种重要的修饰反应
一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
•酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 等。
1．巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋白 侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空 间构象、特性和功能。
①乙酸酐修饰 ②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰. ③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger 反应) ④氨基的烷基化.这类试剂包括 卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等. ⑤丹磺酰氯(DNS)修饰. ⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即 Edman反应)
3．羧基的化学修饰
修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶 分子中羧基的数目。
• ①烷基化试剂 烷基试剂中用得最多的是碘乙酸，碘乙 酰胺,巯基乙醇，谷胱甘肽(GSH)。
• E—SH + ICH2COOH(或ICH2CONH2)→E—S— CH2COOH(或E—S—CH2CONH2)+HI ②汞试剂 这类试剂如HgCl2，对氯汞苯甲酸(pCMB)和 2—氯汞硝基苯酚等。
2．氨基的化学修饰