单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）

荧光定量PCR检测试剂盒说明书

规格：48份/盒

用途：单核细胞增生李斯特氏菌PCR体外检测。

检测原理：

试剂盒中含有单增李斯特氏菌特异的引物，当样品中含有单增李斯特氏菌时，前增菌后提取的单增李斯特氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中单增李斯特氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交,同时被Taq酶水解,把探针上的荧光基团和淬灭基团分开,从而通过荧光增量来实时判断单增李斯特氏菌的存在。

产品盒组成：

试剂盒的保存条件及有效期：

1．本试剂盒于-20℃保存。

2．有效期为6个月。

适用仪器：

ABI7500，9600系列，MJopticon2，Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可。

实验方法：

1．取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；采纳经典酚氯仿提取法，将提取到的模板进行检测或保存于-20℃以待检测。

2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶,按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq 酶。

3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。阴、阳性对比使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对比各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。

4．上机扩增、检测区：反应条件为95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，60℃：40sec〔信号采集〕，40个循环。反应体系设为25ul。

关于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。

结果分析：

关于MJOpticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入1-15之间的荧光值，进行Ct值的设置或拖动基线到合适的位置以确定ct值。

关于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原那么为阈值线刚好超过正常阴性对比品扩增曲线的最高点，而不显示Ct值为宜。

质控标准：

本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。定量检测线性范围为：10-1010拷贝/ml。

阴性对比无Ct值显示或Ct值为40，阳性对比的Ct值≤30.0，否那么为实验失败。

结果判断：

1．检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。

2．检测样本Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，假如Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否那么报告阴性。

3．样本不显示Ct值时，报告阴性。

试剂盒使用本卷须知

1．本试剂盒仅用于体外检测和研究用途，开始使用前请认真阅读本说明书全文。

2．实验必须严格分区操作：PCR前预备区——预备实验试剂；样本处理区——待测样本、模板处理；检测区——PCR扩增、检测。

3．有关实验室治理规范请参照国家相关部门颁布的基因扩增实验室的治理规范执行。4．