RT-PCR中引物的选择指南

验
是用来扩增目的片段，可选用 AMV。
三.常用内参引物的参考序列:
内参基因名称 基因库序列号
引物名称 序列
引物位置
引物 Tm
最佳退火 扩增长 温度 ℃ 度
Human actin beta
F305 Ctgggacgacatggagaaaa 305-324 52.3
59.4 564
R868 aaggaaggctggaagagtgc 868-849
的 CDNA，42-45℃范围具有最佳活性。55℃仍有活性，因
修饰后
仍有活性，因此可以适合具有大量二级结构的模板，提高反
此可以适合具有大量二级结构的模板，提高反应的褪火温
应的褪火温度。
度。
适用实
基因比较复杂、有二级结构或 GC 含量较高的 RT 反应，如果
RT-PCR 反应中如果使用来做检测，价格比 AMV 稍便宜。
ü 病毒鉴定，因为大多数病毒的序列是未知的，所以在 RNA 病毒的研究中一般用随机引物进行扩 增并进行鉴定。 3. oligo(dT)引物： Oligo(dT)一般指的是多个 T 碱基连接而成的寡聚引物，主要是针对真核生物具有 Poly(A)尾 时设计的用于 RT，因此 RT-PCR Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。因为 poly(A)+RNA 大概 占总 RNA 的 1%到 2％，因此之前必须先把 poly(A)+RNA 提取出来。所以与使用随机引物相比， cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对 RNA 和引物的 比例及 poly(A)+选择进行优化。建议每 20μl 反应体系使用 0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18 适 用于多数 RT-PCR。 3.1 oligo(dT)适应范围： Oligo(dT)针对真核生物具有 Poly(A)尾设计，所以特异性好，但是同时对 RNA 样品要求较 高，是生成全长 cDNA 的大多数两步 RT-PCR 应用中较受欢迎的引物延伸法。原因是许 多逆转录酶不能高效地将全长 mRNA 序列转录到 5’端。但是即使有少量降解也会使全长 cDNA 合成量大大减少。因此对于较长的 mRNA，或是因为 RNA 中间可能具有的二级结构等往 往使得反转录反应提前终止，也导致不能达到 mRNA 的 5’末端，就是扩增片段的长度有限，这 一方面和 RNA 完整性和结构有关，另的限制在于反转录酶的延伸能力，用 oligo dT primer 扩增 可能出现扩增出来的片段长度短，导致想要的那部分序列在一次扩增的时候，没有被扩增出来， 虽然都有 mRNA 的 3’端，但是序列信息多位于 3’-UTR 附近，有用信息很少，不利于序列的识 别和分析，这个时候同时采用随机引物和 Oligo(dT)启动反转录反应是一个更好的选择，从而获 得目的基因的全长序列。在采用寡（dT）引物时，推荐选择 3’端引物用于以后的 PCR 反应。
反应的敏感度和特异性。
解也会是全长 cDNA 合成量大大减少。
适用实验
1.RT-PCR 实验中，合成带有或不带有
poly(A)的 cDNA。2.长片断的 mRNAS 5’
的 RT-PCR。3.模板 RNA 具有较多二级结 适合于模板是 Poly(A)+RNA 的 RT-PCR 实验，
但是如果以 RNA 为模板进行一
RT-PCR 中引物的选择指南
一.用于 RT-PCR 的引物 1.特异性引物（跨内含子设计引物） 2.随机引物（Random primer） 3. oligo(dT)引物
二.反转录酶 M-MULV 和 AMV 三.常用内参引物的参考序列
一．用于 RT-PCR 的引物 一般做 RT-PCR 进行第一链 cDNA 合成的起始可以使用特异性引物、随机引物（Random
因为体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，所以随机引物法是三种方法中特 异性最低的，通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。所以随机引物介导制备的 cDNA 产物复杂程度高，从而降低了后续 PCR 反应的敏感度和特异性。为了获得最长的 cDNA，需要 按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例。随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20μl 反应体系。 2.1 随机引物优先应用范围： ü RT-PCR 实验中，合成带有或不带有 poly（A）的 cDNA。 ü 长片断的 mRNA5’—区域的 RT –PCR。 ü 模板 RNA 具有较多二级结构的 CDNA 的合成。 ü 可用于 Northern/Southern 杂交、原位杂交和克隆／噬菌斑杂交的标记探针。mRNA 差异显示。
表二：RT-PCR 中常见的反转录酶 M-MULV、AMV 的应用
名称
M-MULV
AMV
莫洛尼氏小鼠白血病病毒
来源
禽成髓细胞瘤病毒 （avian myeloblastosis virus）
（molomey murine leukemia virus）
特点
DNA-RNA 依 赖 的 聚 合 酶 活
DNA-RNA 依赖的聚合酶活性。DNA-RNA 解旋活性，RNase-H 活
构的 CDNA 的合成。4.可用于
如果目标序列位于基因的 5’端，那么推荐
步法检测目标基因，一般建议
Northern/Southern 杂交、原位杂交和 采用随机六聚体引物或随机六聚体与寡
添加特异性引物。一般第一链
克隆、噬菌斑杂交的标记探针。 5.mRNA (dT)n 引物的混合物用于逆转录步骤。一般
表一：三种引物应用特点
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ名称
特异性引物
Random 引物
oligo(dT)
序列
该类引物与模板序列特异性 结合。
多个任意的碱基连接而成的一套寡聚 多个 T 碱基连接而成的寡聚引
引物组，常见的是 random（6），random 物， oligo(dT)10-18，
（9），random（10），
特点
比较短小，随机组合丰富，与模板结合 针对 Poly(A)尾巴设计，与使用随机引物相
这样从和 cDNA 和基因组 DNA 中扩增的片段大小不同(基因组 DNA 中的包含内含子扩增的 要大些)，从而可以通过用合适的延伸时间来限制基因组中大片段的扩增，消除基因组 DNA 污染 的影响(这要求跨越的内含子要大些)。
1.2 上游或者下游引物或者两者，引物本身在两个不同的外显子上 注意引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，少于 8bp 左右。这样的引物就不能从基因
模板必须是已知的，可以消除 位点多，在 RT 种是含有二级结构模板 比，cDNA 的数量和复杂度要少得多，但同时，
RT-PCR 时基因组 DNA 污染对结 的最佳组合，但同时导致制备的 cDNA 对于比较长的 mRNA，他经常不能延伸到 5’
果的影响。
产物复杂程度高，从而降低了后续 PCR 端。但对 RNA 样品要求较高，即使有少量降
随机引物，一般指的是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是 random（6），random （9），random（10），如果 6 个碱基的随机序列，则是 5’-d（NNNNNN）-3’，共有 4 6 条引物。
原核生物由于没有 poly(A)，因此在进行总 mRNA 的 RT 时要用到随机引物，由于其比较短 小，且随机组合丰富，所以在 mRNA 上的结合也很多，产生短的，部分长度的 cDNA，因此也 可以进行有效的 RT。这种方法经常用于获取 5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶 不能复制的终止位点的 RNA 模板获得 cDNA。因此一般适用于长的或具有发卡结构的 RNA；适 用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有单一模板 RNA 的反转录反应。在 RT-PCR 用随机引物制备 CDNA 时，要去除总 RNA 中的 tRNA 、rRNA，只保留 mRNA。
91-110
57.5 60.4 517
human GAPDHBC004109
Rat GAPDHBC059110
Mouse GAPDHM32599 Rat 18S rRNAM11188 human 18S rRNAM10098 mouse 18S rRNAK013364
性。
RNase-H 活性较低，
性较强，有较强的反转录活性，最适 45-50℃.在 45-60℃很
有较强的反转录活性，42 范围具有最佳活性。制备 CDNA
宽的范围具有活性。制备 CDNA 最长可 13Kb。
最长可 9Kb。
点突变后 RNase-H 活性完全消失，因此可以扩增长达 13Kb
可以扩增长达 13Kb 的 CDNA，42-45℃范围具有最佳活性。55℃
反转录酶，又称逆转录酶，是依赖 RNA 为模板的 DNA 聚合酶的统称。美国科学家 H.M.Temin 和 D.Baltimore 在 1970 年发现了反转录酶，并因此获得了 1975 年的诺贝尔生理学医学奖。目 前常用的反转酶主要有 AMV（avian myeloblastosis virus）和 M-MULV（molomey murine leukemia virus）两种反转录酶。AMV 来源于禽成髓细胞瘤病毒，最适反应温度在 42℃，具有 较强的反转录活性和 RNase-H 活性， RNase H 是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解 杂交到 DNA 链上的 RNA 磷酸二酯键，故能分解 RNA/DNA 杂交体系中的 RNA 链，从而限制了 cDNA 的合成长度。 与之对应的 M-MULV 该酶基因来源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒，在具有较 强的反转录活性的同时，却具有较低的 RNase-H 活性，所以它可以获得较长的 cDNA 片段。目 前通过基因工程的方法降低 RNase-H 活性，使得 M-MULV 的反转录活性大大提高，提高酶的 热稳定性，因此目前 M-MULV 应用最广。
组 DNA 扩增，从而消除基因组 DNA 污染的影响(这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较 多的选择，引物本身质量可能不好。
2.随机引物（Random primer） 在两步法 RT-PCR 中，mRNA 必须先转录为 cDNA。在这种情况下，采用不依赖序列的引
物，例如随机引物和 oligo(dT)引物。
52.6
BC002409
F1379 agcgagcatcccccaaagtt 1379-1398 57.3
54
285
R1663 gggcacgaaggctcatcatt 1663-1644 56.3
Rat actin betaNM_031144
F18 R224
cacccgcgagtacaaccttc cccatacccaccatcacacc
primer）、oligo(dT)三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成 cDNA 的量、种类及 效果（如表一）。 1.特异性引物（跨内含子设计引物）
对于 RT-PCR，引物设计质量影响 RT 的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以 第一链 cDNA 合成不推荐使用。但是如果以 RNA 为模板进行一步法检测基因表达情况，一般建 议添加特异性引物，这样设计的主要目的是消除 RT-PCR 时基因组 DNA 污染对结果的影响。跨 内含子设计引物有两种做法（如下图 A 和 B）： 1.1 在两个不同的外显子上设计引物，上下引物分别位于不同的外显子上
CDNA 合成不推荐使用。
差异显示。6.病毒鉴定，因为病毒序列 采用 60μM 随机六聚体和 2.5μM 寡(dT)n。
大多数是未知的，在 RNA 病毒的研究中
一般用随机引物进行扩增并进行鉴定。
纯化方式 HAP, ULTRAPAGE, HPLC
HAP
HAP
二. 反转录酶 M-MULV 和 AMV
通常 M-MULV 用于普通的 RT 反应，AMV 用于基因比较复杂、有二级结构或 GC 含量较高 的 RT 反应，如果 cDNA 要用于克隆表达，建议使用 M-MULV 或 AMV。
18-37 224-205
54.5 60.4 207
54.4
F694 gagagggaaatcgtgcgtgac 694-714
54
57.1 452
R1146 catctgctggaaggtggaca 1146-1127 53.2
Mouse actin betaNM_007393 F91
atatcgctgcgctggtcgtc