miRNA及其inhibitor转染方法

mirna inhibitor设计方法

mirna inhibitor设计方法
设计miRNA抑制剂通常需要考虑以下几个方面的因素，这些因素涉及到miRNA的结构和功能：
1.miRNA序列和结构分析：首先，需要对目标miRNA进行详细的序列和结构分析。

这包括miRNA的碱基组成、稳定性、可能的结合位点等信息。

2.抑制剂设计：抑制miRNA的方法主要有两种，一是通过合成miRNA反义链，使其与目标miRNA发生碱基互补，形成双链结构；二是设计合成小分子化合物，通过与miRNA特定的结合位点相互作用，抑制miRNA的功能。

3.亲和力和特异性：设计的miRNA抑制剂需要具有较高的亲和力，以确保与目标miRNA 的结合强度。

同时，为了减少对非目标miRNA的影响，需要保证抑制剂的特异性。

4.化合物的稳定性：抑制剂需要在体内维持较长时间的稳定性，因此需要考虑化合物的生物稳定性和药代动力学。

5.细胞摄取和递送：要实现miRNA抑制的效果，设计的抑制剂需要能够有效地进入细胞，并在细胞内达到目标miRNA的浓度。

因此，适当的递送系统也是设计过程中需要考虑的因素之一。

6.生物学效果评估：在设计阶段后，需要进行体外和体内的生物学效果评估。

这包括在细胞水平上检测miRNA表达水平的变化，以及在动物模型中评估miRNA抑制剂的生物学效果和安全性。

总体而言，miRNA抑制剂的设计需要结合miRNA的结构和功能特点，利用合理的设计方法确保抑制剂在体内表现出良好的稳定性、特异性和生物学效果。

锐博生物_ribobio_miRNA产品使用说明

miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。

运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。

收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。

2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。

使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。

锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。

注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。

mimics 使用说明

注：1）不同细胞的生长速度不同，接种细胞的数量需依经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布。

b. 悬浮细胞：接种1×105~5×105个细胞至含有500μl完全培养基的24孔板。

2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a. 稀释mimic：用50μl 1X ribo FECT TM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM miRNA mimic储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。

b. 混合液制备：加入5μl ribo FECT TM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。

注：1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。

c. 将ribo FECT TM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。

注：混合液加入原细胞培养基，无需移除或更换。

d. （可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）。

e. 将培养板置于适当的培养条件下培养24~96h（培养时间与实验目的相关）。

表2 使用ribo FECT TM CP转染miRNA mimic用量参考v1: ribo FECT CP Buffer (1X)； v2: 20μM miRNA mimic储存液； v3: ribo FECT CP Reagent； v4: 细胞培养基注： 1）*：实验示例用量参考。

2）表中数据仅供参考，对于部分细胞类型的转染试剂用量可进一步优化。

3）转染质粒时，转染试剂用量可优化至1μl (24孔板)。

3）效果检测miRNA mimic/inhibitor作用效果往往通过功能方面检测，转染完成后24~72小时均可进行检测，最佳检测时间与细胞类型及研究的miRNA有关。

以下为几种常用的miRNA效果检测方法：a. 使用qPCR，基因芯片，新一代测序等方法检测靶基因mRNA转录水平，甚至全基因表达图谱是否发生相应改变；b. 使用Western Blot，蛋白芯片等方法检测靶基因的蛋白水平是否发生相应改变；c. 检测细胞功能（细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等）是否发生相应变化；d. 通过靶基因siRNA来确认miRNA mimic/inhibitor的作用；e. 通过与miRNA靶基因双荧光素酶报告载体（锐博生物可提供构建服务）共转来验证miRNA mimic/inhibitor的作用。

miRNA、miRNAmimics和miRNAinhibitor

miRNA、miRNAmimics和miRNAinhibitor 展开全文
microRNA(miRNA)是真核细胞生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度约为22bp。

miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNA（primary miRNA 。

pri-miRNA）,然后在在核内有Drosha加工成60-70bp的发夹状RNA，即前体miRNA（miRNA percuser,pre-miRNA）,在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出细胞核，在胞质中被Dicer剪切成为成熟miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，与mRNA完全或不完全配对结合来调节基因表达。

miRNA mimics是化学合成的成熟miRNA模拟物。

miRNA agomir是经过特殊化学修饰的miRNA激动剂，转染至细胞后模拟内源性miRNA发挥作用。

miRNA mimics进一步增强內源miRNA的调控作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得行（gain-of-function）研究。

实验表明miRNA mimics在细胞和动物实验水平，都可发挥miRNA作用。

miRNA inhibitor是化学修饰的miRNA抑制物，通过特异的靶向抑制某个miRNA分子，可以削弱內源miRNA的金银沉默效应，提高蛋白的表达量，进行功能缺失行（loss-of-function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。

mirna inhibitor作用机制

mirna inhibitor作用机制Mirna Inhibitor作用机制Mirna Inhibitor是一种新型的RNA分子，它可以通过抑制microRNA（miRNA）的表达来调节基因表达。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，它们通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）结合来抑制基因表达。

miRNA在许多生物学过程中发挥着重要的调节作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢和免疫反应等。

Mirna Inhibitor的作用机制是通过与miRNA结合来抑制miRNA的功能。

Mirna Inhibitor是一种单链RNA分子，它的序列与miRNA 的互补序列相同。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它会阻止miRNA与靶基因的3'UTR结合，从而抑制miRNA的功能。

这种抑制作用可以通过多种方式实现，包括竞争性结合、miRNA降解和miRNA转运等。

竞争性结合是Mirna Inhibitor最常见的作用方式。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它会与miRNA竞争性地结合到靶基因的3'UTR上，从而阻止miRNA与靶基因的结合。

这种竞争性结合可以有效地抑制miRNA的功能，从而调节基因表达。

另一种作用方式是通过miRNA降解来实现。

当Mirna Inhibitor与miRNA结合时，它可以促进miRNA的降解，从而减少miRNA的表达量。

这种降解作用可以通过RNA酶的介导来实现，例如Dicer和Argonaute等。

最后一种作用方式是通过miRNA转运来实现。

当Mirna Inhibitor 与miRNA结合时，它可以促进miRNA的转运，从而减少miRNA 的表达量。

这种转运作用可以通过RNA结合蛋白的介导来实现，例如Exportin-5和Ran-GTP等。

Mirna Inhibitor是一种新型的RNA分子，它可以通过抑制miRNA 的表达来调节基因表达。

miRNA的研究方法

科研(kē yán)中的miRNA研究(yánjiū)方法总结microRNA(miRNA) 是一类(yī lèi)长度在22nt左右(zuǒyòu)的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物(zhíwù)、病毒等多种有机体中。

1993年，Lee等人在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现了控制着线虫时序性发育的lin-4。

2000年，Reinhart等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。

随后的几年时间里，许多研究人员相继发现了这类RNA，并将这些具有时空表达特异性的非编码小分子RNA命名为microRNA(miRNA)。

从长的初级miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的单链miRNA到与靶标RNA结合，至少需要四步：首先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8组成的复合物将初始miRNA 转录本（pri-miRNA）加工成miRNA前体（pre-miRNA）；接着由转运蛋白Exportin-5和Ran GTP酶将miRNA从细胞核转运到细胞质中；第三步是由另一种核糖核酸酶ⅢDrosha将miRNA前体剪切成成熟的miRNA双链，miRNA双链打开，其中一条进入到RNA诱导的沉默RISC复合体（RISC）中，该复合体还包含TarRNA结合蛋白（TRBP）；最终RISC复合体根据miRNA与靶标RNA的互补配对，对靶基因进行剪切，或者翻译抑制。

图 1 miRNA生物学调控过程（摘自文献8）miRNA通过作用于相应靶mRNA，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。

预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。

近些年，随着科学研究的进展，大量的miRNA已经被鉴定出来，截至目前发现的人的成熟的miRNA有2578条，小鼠的有1908条。

虽然miRNA的数量很多，但大多miRNA的功能并不为人所知。

MicroRNA Inhibitor产品使用手册

MicroRNA Inhibitor产品使用手册规格:5nmol*2(对照为2.5nmol*4)纯化方式:HPLC 纯化产品形式：干粉贮存条件：在-20℃或者-80℃保存期：1 年，在-20℃或者-80℃质量控制：PAGE 检测确定产品是准确分子量大小的单链的MicroRNA Inhibitor HPLC 纯化并分析单链的MicroRNA Inhibitor 纯度>95%●注意事项RNA inhibitors 在操作过程，如果有外源的核酸酶存在，RNA inhibitors容易发生降解。

在进行相关试验中，请带手套进行操作，尽量用无RNAase污染的试剂，试管，移液枪和枪头。

收到产品后尽快贮存在–20°C 或–80°C环境中。

●MicroRNA Inhibitor的重悬在最大转速为4,000 X g 的低速条件下离心EP 管，让MicroRNA Inhibitor 聚集在试管的底部。

1.轻轻的打开管盖.2. 5nmol加入DEPC水250 ul,配成20uM的储备液3.柔和的用移液枪吹打储备液5 次4.根据具体用量情况分装，避免多次冻融5.在重新贮存的时候注意密封好EP 管6.贮存在-80°C，以备使用●转染程序转染效率对不同的细胞株和不同的转染试剂是不同的。

我们建议miRNA inhibitor 的终浓度为15-100nM最优化的转染浓度最终还是需要通过试验来确定。

我们发现典型的试验中最佳的浓度范围是15-100nM，但是优化的浓度范围我们设定在1-100nM 之间。

A：转染试剂的推荐量，根据您订购的试剂不同应做适当的调整B：所显示的添加量是miRNA inhibitor 终浓度为30nM 的量。

由于最大miRNA inhibitor 活性的量在不同的细胞类型是有差异的，所以推荐您自行优化。

C 对细胞密度只是推荐值，不同的细胞株有一定的变化，主要看细胞的大小和生长的状况，一般来说我们推荐细胞融合度在30-70％为佳。

miRNA细胞转染步骤（Entranster）

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下miRNA转染步骤（24孔板）
1.提前1天细胞种植
贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。

如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程
⑴取0.67ug(50pmol)的miRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA
稀释液，终体积为25μl。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的Entranster TM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成
Entranster TM-R4000稀释液，终体积为25μl。

室温静置5分钟。

⑶将Entranster TM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样
器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞
上，前后移动培养皿，混合均匀。

注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小
时得到结果。

mirna inhibitor作用机制

mirna inhibitor作用机制miRNA是一种重要的小分子RNA，它们在许多生物过程中起着调节基因表达的作用。

miRNA通过结合到靶基因mRNA的3'非翻译区域（3'-UTR）来抑制翻译或诱导降解，从而对基因表达进行负性调控。

因此，miRNA在调节细胞分化和生长，细胞周期，凋亡和肿瘤发生中起着重要作用。

miRNA的异常表达被发现在多种疾病中包括癌症，心血管疾病和神经系统疾病中。

miRNA调节的分子途径通常在疾病发生中表现出不同的表达模式，因此将miRNA作为治疗目标成为了一种备受关注的新型治疗策略。

miRNA抑制剂是一种新型的治疗手段，它可以通过抑制被过度表达的miRNA来治疗疾病。

miRNA抑制剂可以分为两种主要类型：miRNA antisense oligonucleotides（AMOs）和miRNA靶向的小分子化合物。

miRNA AMOs是由短链DNA和核苷酸模拟物构成的小分子，在靶标miRNA 5'端启动位点与miRNA互补配对并阻止其与靶mRNA的耦合。

AMO的结合还可以导致miRNA的降解。

miRNA靶向的小分子化合物也是一种重要的miRNA抑制剂。

这些小分子化合物通过与miRNA特定的结构域相互作用来具有选择性地抑制它们的生物活性。

这些小分子化合物在miRNA靶基因表达调节中的各种机制中发挥作用，包括阻止miRNA的成熟和靶mRNA的结合，以及调节miRNA生物合成途径中的信号传递。

miRNA抑制剂作用的主要机制是通过调节miRNA的生物功能。

具体来说，miRNA抑制剂可以促进miRNA的降解，阻止miRNA的成熟和抑制miRNA与靶mRNA的配对。

这些机制都会导致靶mRNA的表达增加，从而影响基因表达模式。

因此，miRNA抑制剂是一种具有潜力的新型治疗策略，可以通过干扰miRNA的调节作用来治疗多种疾病。

随着对miRNA及其抑制剂作用机理的进一步了解，在未来的治疗疾病中将有更广泛的应用潜力。

miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明

miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明RN ：R10032.3产品简介miRNA 是一类具有调控功能的非编码小RNA ，主要通过与靶基因mRNA 3’UTR 完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。

pmiR-RB-Report ™载体是专门用来检测miRNA 作用的检测工具，将基因的3’UTR 区克隆至载体海肾荧光素酶基因(hRluc )下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因(hLuc )作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA 对该基因是否有调控作用。

载体图谱hRluc ：海肾荧光素酶基因，为报告基因； hLuc+：萤火虫荧光素酶基因，为内参基因； 3’UTR Region ：多克隆位点，基因3’UTR 连接位点； Amp r ：氨苄青霉素抗性，用于大肠杆菌筛选。

体积每管含量总含量pmiR-RB-Report™ Species-GeneName~100 ng/μl~50μl ~5μg ~10μg注：质粒可以直接用来实验，甘油菌可以进行质粒扩大提取。

运输保存产品一般以液体的形式常温运输。

收到产品后，请将载体及甘油菌于-20℃以下保存。

质粒可以直接用于实验，甘油菌可直接进行质粒扩大提取。

实验方法图2 pmiR-RB-Report TM 质粒载体使用方法图1 pmiR-RB-Report TM 载体图谱简图细胞转染为了降低由于细胞密度、转染效率、试剂用量等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 细胞类型与转染试剂：由于实验需要同时转染小分子RNA和质粒载体两种物质，因此，细胞类型、细胞状态和转染试剂是决定实验成败的关键因素，建议选择转染效率较高的细胞系进行实验，如293T，Hela，A549，而转染效率较低的细胞系不适合进行本实验的检测。

inhibitor and mimics转染使用说明方法学

mmu-miR-125a-5p研究策略Standard 报价Standard 报价2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicr ON™ mmu-miR-125a-5pmimic2ng 300 RMB 5ng 500 RMBmicr OFF™ mmu-miR-125a-5pinhibitor,转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5p inhibitor;2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000ul RNase-free water配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的RNA混合。

室温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合6．混合稀释的RNA（第4步）和稀释的Lipofectamine 2000（第5步）。

在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

复合物可以在室温保持6小时稳定7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入500ul培养基,混匀。

锐博生物_ribobio_miRNA产品使用说明

miRNA产品使用说明RN：R10034.5 产品简介micr ON™ miRNA mimic是miRNA模拟物，化学合成的成熟miRNA双链，即用型；micr OFF™ miRNA inhibitor是miRNA抑制物，化学修饰的成熟miRNA互补单链，即用型；micr ON™ miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA 激动剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型；micr OFF™ miRNA antagomir是特殊化学修饰的miRNA 拮抗剂，适用于细胞实验、动物实验，即用型。

运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。

收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。

2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高内涵筛选试验，可选择miRNA Library。

使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。

实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 转染浓度miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。

锐博生物推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM，miRNA inhibitor浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。

注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。

miRNA动物实验技术手册

进技术，成功开发出国际一流品质miRNA研究工具：micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir。本产品采
用特殊化学修饰和末端标记技术，增加体内细胞的吸收作用，提高其抵抗RNA酶降解的能力；经高度脱盐处理，降低毒副
作用，使其在动物实验中操作简单，且发挥稳定和高效的作用。
实验方法与结果
6周龄的卵巢切除小鼠连续三天尾静脉注射micrOFFTM antagomir-2861（80 mg/kg体重)，再在第4天、第3周及第6 周收集股骨检测HDAC5蛋白表达水平及骨形成相关指标。
尾静脉注射antagomir-2861（80mg/kg体重）
6周龄OVX小鼠
1天
2天
实验结果：
2天测心电图
3天测心电图
4天
……
14天
测心电图
……
测心电图
实验结果：
A

B
图2 经Northern Blot检测，通过尾静脉注射antagomir-16，小鼠的肝、肾、肺、心脏、骨骼肌、皮肤、肾上腺、卵巢、小肠、结肠、脂肪及骨髓中的 miR-16表达均受到抑制。B：
图3 注射antagomir-328后，小鼠体内miR-328表达水平降低且房颤程度下降，而注射对照（不配对）的 antagomir则无此效果。
工具 miRNA mimic miRNA inhibitor miRNA agomir
miRNA antagomir
miRNA病毒表达载体
表一 miRNA功能研究常用工具比较
功能模拟高表达miRNA 竞争性抑制miRNA 模拟高表达miRNA
竞争性抑制或特异性降解内源miRNA
高表达miRNA

miRNA及其inhibitor转染方法

m i R N A及其i n h i b i t o r转染方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1miRNA及其inhibitor转染方法1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。

（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。

分装后于－80 ℃保存。

2经过调整，细胞状态较好。

晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。

做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。

3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。

（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 minb 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min（2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minb用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min（3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。

HiPerFect转染试剂的使用

HiPerFect转染试剂的使⽤在做miRNA的相关实验中，在验证靶基因⽅⾯，通常是向靶细胞转染miRNA mimics，或者是构建稳定过表达的miRNA的细胞株，然后做WB即可。

我的靶细胞是RAW264.7，但向这种细胞株转染miRNA mimics时，使⽤lipo2000或lipo3000的效率没那么⾼，不太容易做出结果（⽂献中有⼈使⽤的，效果很好，但我实验中总是做不出来）。

后来在QIAGEN官⽹上搜到了⼀个转染试剂，HiPerFect，看介绍这个转染试剂是专门⽤于转染miRNA的。

以下是实验流程，具体实验我还没做，只是翻译了说明书中的内容。

1. 将2.5x10e5个RAW264.7细胞铺在6孔板中，培养基体积为2.3mL，含FBS与双抗。

2. 转染时，将150ng的miRNA稀释到100uL的不含⾎清的培养基中（通常使⽤OPTI-MEN培养基），如果是miRNAinhibitor，剂量增加10倍，使miRNA的终浓度为5nM，这个浓度根据实验⽽定，⽂献中使⽤lipo2000或3000转染miRNA mimcs时的终浓度是20nM-100nM，但QIAGEN的说明书中提到，这个转染试剂的优点在于能在低浓度⽔平上进⾏miRNA的转染。

加⼊12uL的HiPerFect到OPTI-MEM中，混匀。

说明书中还提到，在正式实验前，最好根据⾃⼰实验室的条件与靶细胞，优化⼀下剂量。

miRNA mimics的储备浓度通常是20uM，如果要使终浓度为100nM，那么就要加10uL的储备液。

3. 在常温下孵育5到10minj。

4. 将上述的转染复合物逐滴加到6孔板中，轻轻混匀。

5. 将细胞培养板放到孵箱中，在24到72⼩时后检测基因表达量（我觉得等细胞长到80%密度的时候就⾏），如果细胞数⽬过少，中间记得更换新培养基。

以下是说明书中提供的参考数据（6孔板的⼀个孔）：。

miRNA常用实验方法

miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。

因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。

我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。

miRNA常用实验方法

miRNA常⽤实验⽅法miRNA常⽤实验⽅法⼀、miRNA的检测⽅法miRNA的realtime-PCR检测⽅法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计⽅法：1）stem-loop RT引物设计：基于通⽤的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通⽤茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通⽤茎环序列后架上mi RNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（⼀般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通⽤的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

⼀般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进⾏电泳检测产物是否单⼀（因产物长度很⼩，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录miRNA的反转录与⼀般基因的反转录过程基本相同。

因为其产物很短，⽤最普通的逆转录酶即可。

我们⼀般使⽤的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：RNA 500ng~2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补⾄10ul程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。

miRNA及其inhibitor转染方法

miRNA及其inhibitor转染方法1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。

（1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水；（2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水；（3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水；（4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水；对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。

分装后于－80 ℃保存。

2经过调整，细胞状态较好。

晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿7.0×105细胞。

做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。

3上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。

（1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 minb 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min（2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minb用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 minc 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 mind 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min（3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。

miRNAinhibitormiRNAmimc

miRNAinhibitormiRNAmimc请教一下，使用miRNA inhibitor或者miRNA mimc后这个miRNA的表达水平会相应抑制或上升吗，还是相应的miRNA表达水平改变不一定，主要是检测下游靶基因的改变？望高手指点，谢谢！miRNA inhibitor will functionally inhibit endogenous miRNA and thus releasing the suppression on downstream genes.However, many paper also showed that miRNA inhibitor decreased miRNA level, possibly due to degradation.2) miRNA mimic will not change the endogenous miRNA expression. However, most common miRNA mimics are miRNA precursors, so they can be processed into corresponding mature miRNAs.miRNA inhibitors的应用l 利用miRNA inhibitors模拟内生miRNA活性来研究Loss-of-function效应l 筛选调控基因表达和影响细胞发育过程的miRNAsl 深入研究miRNA在一些生物过程中的作用，如细胞的发育、增殖、分化和凋亡l 发现和验证内源性的miRNA target作用原理化学合成的miRNA inhibitors是单链RNA分子，转染至细胞后特异性抑制miRNA功能，可以结合到成熟的miRNA上、干扰miRNA 的生成、阻止miRNA加工、或者阻止其从核内转运到胞浆发挥作用。

理论上是抑制miRNA调控作用。

单链的2’甲氧设计增强稳定性。

miRNA、miRNA mimics与miRNA inhibitor

miRNA、miRNA mimics与miRNA inhibitor 的区别
2011-07-15 10:24:26| 分类：miRNA | 标签：mirna mimics inhibitor |举报|字号订阅microRNA(miRNA)是真核心生物中的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度约为22bp。

miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNA （primary miRNA，pri- miRNA），然后在核心内由Drosha加工成60-70个核苷酸的发夹状RNA，即前体miRNA（miRNA precusor，pre- miRNA），在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为成熟的miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，基于与mRNA完全或不完全酸对来调节基因表达。

miRNA mimics是化学合成的成熟miRNA模拟物，miRNA agomir是经过特殊化学修饰的miRNA激动剂，转染至细胞后模拟内源性miRNA发挥作用。

miRNA mimics进一步增强内源miRNA的调控作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of-function）研究。

实验表明miRNA mimics在细胞和动物实验水平，都可发挥miRNA的作用。

miRNA inhibitor是化学修饰的miRNA抑制物，通过特异地靶向抑制某个miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性（loss-of-function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。