土壤中细菌、真菌呼吸作用强度的测定
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。
常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。
常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。
生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。
该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。
碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。
生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。
生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。
该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。
这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。
生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。
但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。
不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。
此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤呼吸作用名词解释
土壤呼吸作用名词解释土壤呼吸作用是指土壤产生并向大气释放二氧化碳的过程。
土壤呼吸作用主要由土壤微生物(异养呼吸)和根系(自养呼吸)产生.除植被冠层光合作用，土壤呼吸作用是陆地生态系统碳收支中最大的通量.因此，精确预测陆地与大气之间碳交换需要深入理解影响土壤呼吸作用的主导因子，特别是对其主要组成部分土壤微生物和根系呼吸作用的影响机理.土壤微生物和根系呼吸作用主要是土壤中生物代谢作用的结果，因此能够影响生物活动的生态因子都会导致其呼吸强度的变化，如气候因子、土壤因子、植被及地表覆被物等.此外，人类活动引起的大气C0'浓度剧增及由此导致的增温效应，不仅是目前人类所面临的最严峻的全球环境问题，而且直接或间接地影响着土壤微生物和根系呼吸作用.同时，人类活动本身也会对土壤微生物和根系呼吸作用产生影响，如放牧、施肥、农药、重金属污染等扩展资料：土壤呼吸(Soil Respiration)是指土壤释放二氧化碳的过程，严格意义上讲是指未扰动土壤中产生二氧化碳的所有代谢作用，包括三个生物学过程(即土壤微生物呼吸、根系呼吸、土壤动物呼吸)和一个非生物学过程，即含碳矿物质的化学氧化作用。
森林土壤呼吸是陆地生态系统土壤呼吸的重要部分，其动态变化将对全球碳平衡产生深远的影响[9]。
全球森林过度采伐和其他土地利用变化导致土壤CO2释放的增加量，占过去两个世纪来因人类活动释放的CO2总量的一半，是除化石燃烧释放CO2导致大气CO2浓度升高的另一重要因素。
森林土壤呼吸也是目前已建立的长期监测CO2通量网站的重要研究对象之一。
是研究世界碳循环的重要课题。
对生态学、环境科学及地球表层系统科学意义重大。
土壤呼吸作用，一般指土壤释放CO2或吸收O2的强度，可分为自养型呼吸(根呼吸和根际微生物呼吸)和异养型呼吸(微生物和动物呼吸)，自养型呼吸消耗的底物直接来源于植物光合作用产物向地下分配的部分,而异养型呼吸则利用土壤中的有机或无机碳。
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤中细菌总数的测定
三 材料与器材
无菌培养皿12套、1 mL无菌移液管10 支、 土壤样品、天平等。
四 操作步骤
无菌平皿编号→制备土壤稀释液→ 倾注 平板→ 培养(48h) → 计数
五 注意事项
倒平板时要注意控制培养基的温度。 稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且 每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。 为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平 皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。
实验三实验三土壤中细菌总数的测定土壤中细菌总数的测定一教学要求通过土壤中细菌总数的测定了解微生物数量的测定方法掌握平板菌落计数的原理和方法二实验原理1测定微生物生长的方法?directmethodsdirectcountingcoultercounter?indirectmethodsviablecellmethodsmembranefiltrationmethodsmostprobablenumbermpndetectchemicalproductsormetabolicactivityturbidity?alternativemethodsforviablecellcounts22theplatecountviablecounttheplatecountviablecount?thenumberofbacteria
土壤呼吸影响因素及测定方法的研究进展
山东林业科技 2021 年第 2 期 总 253 期 SHANDONG FORESTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY 2021.No.2文章编号：1002-2724(2021 )02-0100-08土壤呼吸影响因素及测定方法的研究进展张 萌!-2'3，卢 杰!'2'3* ，任毅华®收稿 H 期:2021-02-28基金项目：科技部国家野外科学研究观测站(生态系统)运行补助项目(2015-2020)作者简介：张萌(1997-)，女，在读硕士，主要从事森林生态学方TV 研究工作，E-mail : ******************通讯作者：卢杰(1973-)，男，教授，主要从事森林生态学的研究与教学工作，E-mail ： ***************(1.西藏农牧学院高原生态研究所，西藏林芝860000；2.西藏高原森林生态教育部重点实验室，西藏林芝860000；3.西藏林芝高山森林生态系统国家野外科学观测研究站，西藏林芝860000)摘要：在全球气候正在经历变暖的情况下，土壤呼吸作为碳输出的主要途径而受到广泛的关注，研究土壤呼吸不仅仅可O帮助人类面对全球气候变暖的问题，还会影响到人类未来的发展。
本文通过对土壤呼吸影响因素的相关文献的查阅、整理、归 纳，总结了影响土壤呼92因素，其中主要包括3个方T ：第一是生物因素，主要包括植被、根系、凋落物与土壤微生物等方T ,但主要是植物和土壤微生物状4 ；第二是非生物因素，例如温度，土壤湿度O 及土壤的理化特性；第三是其他因素，主要包括施 肥、森林采伐、耕作方式和火烧等。
综述了目前国内外土壤呼9方法，并且探讨了每种测量方法2原理、技术、 、缺点O。
土壤呼9测量的 方法便是动态气室系统，并且在需要可O 与微气象方法结合使用。
关键词：土壤呼9；影响因素；生物因素；非生物因素； 方法中图分类号：Q142.3文献标识码:AResearch Progress on Influencing Factors and Determination Methods of Soil Respiration ZHANG Meng 1%2'3，LU Jie^UREN Yihua 1%2%3(1. Institute of Tibet Plateau Ecology, Tibet Agriculture & Animal Husbandry University, Nyingchi Tibet 860000; 2. Key Laboratory of Forest Ecology in Tibet Plateau(Tibet Agriculture & Animal Husbandry University), Ministry of Education, Nyingchi Tibet 860000 ; 3. Linzhi National Forest Ecosystem Observation & Research Station of Tibet, Nyingchi Tibet 860000)Abstract ： As the global climate is experiencing warming, soil respiration, as the main way of carbon output, has attracted extensive attention. Studying soil respiration can not only help human beings to face the problem of global warming, but also affect the future development of human beings.In this paper, the factors affecting soil respiration were summarized by referring to, sorting out and summarizing the related literatures of soil respiration factors, which mainly included three aspects. The first is biological factors, mainly including vegetation, root system, litter and soil microorganisms, but mainly plants and soil microorganisms.Second, abiotic factors, such as temperature, soil moisture, and physical and chemical properties of the soil;The third is other factors, mainly including fertilization, deforestation, farming methods and burning.This paper summarizes the methods of soil respiration measurement at home and abroad, and discusses the principles, techniques, advantages, disadvantages and application scope of each method.The preferred method of soil respiration measurement is the dynamic chamber system and can be used in conjunction with the micrometeorological method when needed.Keywords ： soil respiration; influencing factors; biological factors; abiotic factors; assay method土壤作为陆地上最大的碳库，通过土壤呼吸的过程进行碳输出叫由环境变化引起的土壤呼吸强 度的微弱改变都有可能对生态系统碳平衡产生显 著的影响。
医学：实验土壤中细菌总数的测定-平板计数
本实验的应用前景
本实验所采用的平板计数法具有广泛的应用前景，可 用于研究不同环境条件下土壤中细菌总数的变化规律。
通过深入探究土壤中细菌总数与环境因素之间的关系， 可以为农业生产、土壤保护和土地资源可持续利用提 供科学依据。
实验误差分析
随机误差
由于随机因素引起的误差，如取样不均匀、计数 误差等。
系统误差
由于实验方法、仪器或操作不当引起的误差，如 培养基质量、培养条件等。
误差来源分析
分析误差的来源，提出相应的改进措施，以提高 实验的准确性和可靠性。
结果可靠性评价
重复性检验
通过重复实验，比较实验结果的一致性和稳定性。
可信度评估
03
CHAPTER
实验步骤
土壤样品的采集与处理
1
ห้องสมุดไป่ตู้
采集具有代表性的土壤样品，并记录采样点的环 境信息。
2
将采集的土壤样品进行筛选和研磨，去除其中的 石块和杂质。
3
将处理后的土壤样品进行称重，记录其质量。
土壤样品的稀释与接种
根据土壤样品的质量， 计算所需的稀释液量。
将稀释后的土壤样品 接种到培养基中，确 保均匀分布。
制备菌悬液
将处理后的土壤样品与无 菌水混合，制备成菌悬液。
稀释菌悬液
将菌悬液进行适当稀释， 使每个菌落来源于一个细 菌。
接种培养
将稀释后的菌悬液接种到 培养基上，放入恒温培养 箱中培养。
掌握平板计数法测定土壤中细菌总数的操作步骤
计数菌落
培养一定时间后，观察并计数培养基 上的菌落数。
结果计算
土壤中细菌总数的测定实验
实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。
2.掌握无菌操作技术。
二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。
2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。
3.无菌水。
4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。
2、倒平板熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。
3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。
5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。
同样方法，依次稀释到10-7。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。
土壤中细菌总数的测定实验
1 / 6实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。
2.掌握无菌操作技术。
二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。
2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。
3.无菌水。
4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。
2、倒平板2 / 6熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。
3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10-7。
4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。
5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。
同样方法，依次稀释到10-7。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3 / 6代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃xx箱内培养48±2h 计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定办法
土壤酶活性及微生物测定配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。
七、八、实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。
仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。
为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。
实验 土壤中细菌总数测定平板计数
• Colony-Forming Units (CFUs) However, keep in mind that if the organism normally forms multiple cell arrangements, such as chains, the colony-forming unit may consist of a chain of bacteria rather than a single bacterium. In addition, some of the bacteria may be clumped together. Therefore, when doing the plate count technique, we generally say we are determining the number of Colony-Forming Units (CFUs) in that known dilution. By extrapolation, this number can in turn be used to calculate the number of CFUs in the original sample.
四 操作步骤
无菌平皿编号→制备土壤稀释液→ 倾注 平板→ 培养(48h) → 计数
五 注意事项
倒平板时要注意控制培养基的温度。
稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且 每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。
为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平
皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。
六 思考题
要测定某种液体饮料中的活细菌总数，除了采 用平板菌落计数法外，还可采用哪些方法？
土壤中细菌总数的测定
一 教学要求
土壤微生物测定方案
三，土壤微生物数量（细菌，真菌，放线菌）的测定1 培养方法（1）稀释平板涂抹法具体操作如下：①准确称取10g（精确到0.001）采集的鲜土，倒入装有90 ml 无菌水的500 ml 的三角瓶中，置于往返震荡机上（120r/min，常温），震荡20 min，使土壤充分分散成为土壤悬液。
②将上面的土壤悬液用无菌移液管吸取 5 ml 到45 ml 稀释液中，即为10-2稀释度，依次按10倍法稀释，制成10-1~-~10-6稀释度。
（注意：每次吸取悬液时，在稀释液中反复吸入和吹出3-~5 次，减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散，每个稀释度需要更换无菌吸管吸取悬液。
）③根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度的悬液接种。
本实验选择细菌的稀释度为10-3-~10-5，放线菌为10-2~-10-4，真菌为10-1~-10-3。
④土壤悬液的接种方法：在无菌培养皿中倒入15~20 ml 选择性培养基，待凝固后，用0.2 ml无菌移液枪吸取0.2 ml各稀释度的土壤悬液，然后立即用涂抹棒将悬液均匀的涂抹于培养基表面。
用同一支吸管接种时，从高稀释度开始，依次接种到低稀释度。
⑤接种了土壤悬液的培养皿，平放在超净工作台20~30 min，使得菌液渗透入培养基内，然后倒置于28~-30°C 恒温培养箱中培养一定时间：细菌1~-3 天，放线菌10-~14 天，真菌3~-7 天。
⑥培养结束后，取出培养皿计数。
（2）稀释培养法一系列稀释度的制作与稀释平板法相同。
根据各类微生物在土壤中数量的多少选择适当的稀释度，分别接种1 ml 稀释液与制作好的液体培养基中，根据需要做3~4 次重复，适温培养。
2 三大类土壤微生物培养基的分离三大类土壤微生物的分离采用稀释平板涂抹法，每个菌种要求做 3 个稀释度，每个稀释度做3-4 次重复，选取细菌和放线菌的菌落在20~-200 之间的培养皿、真菌的菌落在10-~100 的培养皿计数，并计算三次重复的平均值。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(Mierobia lBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L-1 K2SO4（图水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L-1 K2SO4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L-1K2Cr2O7—12 mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
土壤中细菌总数的测定
土壤中细菌总数的测定摘要在生态学、农业科学、环境科学和微生物学等领域中，土壤细菌数量的测定是非常重要的研究内容。
本文介绍了两种主要的土壤细菌数量测定方法：菌落计数法和直接计数法，讨论了各自的优缺点以及操作步骤。
菌落计数法菌落计数法是一种通过在培养基上培养细菌，再进行菌落计数的方式来测定土壤中细菌总数的方法。
其操作步骤如下：1.取一定量的土壤样本，将其加入到含有特定培养基的培养皿中，如TSA、PCA或NA培养基等；2.将培养皿置于适宜的温度下(通常为30℃)，培养一定时间(一般为24~72小时)；3.统计培养皿上出现的菌落数；4.根据不同培养基的菌落特点来进行分类鉴定。
如直径、颜色、质地、形态等；5.计算细菌数量。
此方法的优点是可以准确地测定土壤中特定细菌种群的数目，并且操作简便。
但缺点是需要培养时间长、部分细菌难于培养、还有会产生空心菌落、部分共生细菌会在菌落中互相竞争等。
直接计数法直接计数法是通过使用显微镜对土壤样本中的细菌数量进行计数的方式来测定土壤中细菌总数的方法。
其操作步骤如下：1.取一定量的土壤样本，将其在缓冲盐水中适当稀释；2.取一部分稀释后的样本，在显微镜下观察，并开始计数；3.根据计数结果，计算细菌在原土壤样品中的数量。
此方法的优点是测定速度快，一般只需要数分钟就可以得出结果，并且操作简单，适合于快速测量。
但缺点是对于不同形态的细菌很难区分，不能确定某些细菌是否存活，容易发生误差。
无论使用什么方法，测定土壤中细菌的数量都是非常重要的。
在实验中，根据具体研究需要选择合适的方法，保证实验可重复性。
以上，就是土壤中细菌总数的测定方法的简单介绍。
SIR方法研究真菌、细菌对森林土壤N20贡献量的进展
SIR方法研究真菌、细菌对森林土壤N2O贡献量的进展章伟（福建师范大学，福建福州350007）摘要：土壤硝化、反硝化是产生有害温室气体N2O主要的生物化学过程。
除了原核细菌外还发现真核生物真菌(包括菌根真菌)也能参与土壤的硝化和反硝化过程并排放N2O。
基质诱导抑制呼吸法（SIR）是目前研究真菌与细菌对N2O排放通量贡献的主要方法。
该方法应注意以下几点：（1）诱导剂的选择应该根据不同土壤的理化性质选择，一般选择的诱导剂为葡萄糖，也有选择蛋白胨作为诱导剂。
（2）预实验确定饱和诱导剂的量。
（3）抑制剂应根据土壤理化性质进行选择，一般选择的抑制剂为放线菌酮和链霉素。
（4）确定IAR，最大抑制率的时间。
（5）真菌、细菌对N2O排放贡献量时间段的确定。
关键词：SIR；真菌；细菌；N2O；森林土壤中图分类号S15文献标识码A文章编号1007-7731（2013）05-19-02空气中N2O气体的增加会导致全球变暖[1]，此外N2O也直接或间接破坏平流层中的臭氧[2]。
有研究表明，来自土壤硝化和反硝化产生的N2O占全球大气N2O的90%。
森林土壤又是N2O的重要排放源[3-4]，因此对森林土壤N2O排放机理的研究对估计和控制全球N2O的排放通量尤为重要。
土壤中硝化－反硝化作用是产生N2O的主要过程[6-7]。
从目前认识的土壤N2O排放机理看，原核生物细菌一直被认为是土壤N2O产生的主要参与者[5-6]。
但最近的研究表明，实际过程远比想像中的复杂，除了原核细菌外，还发现真核生物真菌（包括菌根真菌）也能参与土壤的硝化和反硝化过程并排放N2O[8]。
细菌在完全厌氧条件下才能快速、完全地发生反硝化，相比之下真菌可以使用NO3-作为电子受体来进行呼吸作用和反硝化作用。
许多真菌由于缺乏将N2O还原为N2的还原酶而使真菌的N2O产生数量和效率更高。
如真菌P450nor催化NO还原的速度约为300μmol/min·kg，是细菌NO还原酶的5倍[9]。
检测不同环境中的细菌和真菌
探究：检测不同环境中的细菌和真菌一、学习目标知识目标：联系日常现象，说出细菌和真菌分布的广泛性、观察不同形态的菌落图片和菌落实物，说出细菌和真菌的分布特点。
能力目标：探究不同环境中的细菌和真菌的分布。
情感目标：小组成员互相交流，共同完成探究活动，体验与人的合作与交流，养成良好的个人卫生习惯。
二、教学重点：1、细菌和真菌的分布特点，2、组织实施实验的过程。
三、教学难点：1、如何确认培养基中的菌落类型及描述他们的特点。
2、通过探究实验来明白细菌和真菌的分布。
四、课时安排：2课时五、实验准备㈠、目的要求：探究细菌和真菌的分布特点，培养学生动手操作能力、探究能力、合作能力等。
㈡、材料用具：每组两套装有牛肉汁培养基的培养皿（老师准备好无菌培养基）、无菌棉签、培养箱、透明胶带、标签纸、放大镜。
㈢、采集地点分别是菜市场、汽车站、池塘水、土壤、口腔内部、手、钱币、空气中。
㈣、将全班分成9组，每组6人，分别指定每组的采集地点。
六、探究的过程通过培养知道凡接种这些环境的培养基上都有大小不同的细菌和真菌菌落的存在，只有对照组没发现细菌和真菌的菌落。
所以细菌和真菌分布广泛，无论在水中、土壤中、空气中、动植物体内体外，甚至火山口附近等都有细菌和真菌的分布。
6、表达和交流让每小组成员互相交流如何接种、交流每组的不足点和成功之处。
共同完成探究活动，体验与人的合作与交流的快乐，从而使每一组学生探究以后养成良好的个人卫生习惯。
7、评价每组学生探究的得失。
从探究是否遵循对照原则、单一变量原则，重复实验原则，实验操作规范与否。
能否辨别出对照组和实验组。
8、作业：课后探究不同的环境细菌和真菌的多少一样吗？什么样的条件适宜于细菌和真菌的生长和繁殖呢？。
土壤微生物测定方案
2 三大类土壤微生物培养基的分离
三大类土壤微生物的分离采用稀释平板涂抹法，每个菌种要求做 3 个稀释度，每个稀释度做
3-4 次重复，选取细菌和放线菌的菌落在 20~-200 之间的培养皿、真菌的菌落在 10-~100 的培养皿计数，并计算三次重复的平均值。每克干土中微生物数量计算式：
③根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度的悬液接种。本实验选择细菌的稀释度为 10-~10-5，放线菌为 10~-10-4，真菌为 10-1~-10-3。 -3-2
④土壤悬液的接种方法：在无菌培养皿中倒入 15~20 ml 选择性培养基，待凝固后，用 0.2 ml无菌移液枪吸取0.2 ml各稀释度的土壤悬液，然后立即用涂抹棒将悬液均匀的涂抹于培养基表面。用同一支吸管接种时，从高稀释度开始，依次接种到低稀释度。
0.5g、NaCl 0.5g、琼脂 18g、3%重铬酸钾溶液 3.3ml、蒸馏水 1000ml、pH 值 7.2~-7.4
3，真菌：马丁氏培养基（虎红琼脂）：蛋白胨 5g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g、葡萄糖 10g、琼脂 18.5g、孟加拉红 0.033g、氯霉素 0.1g、蒸馏水 1000ml
所有培养基需在湿热灭菌锅中 121°C 灭菌 20-~30 min。
②将上面的土壤悬液用无菌移液管吸取 5 ml 到 45 ml 稀释液中，即为 10-2稀释度，依次按 10倍法稀释，制成 10-1~-~10-6稀释度。（注意：每次吸取悬液时，在稀释液中反复吸入和吹出 3-~5 次，减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散，每个稀释度需要更换无菌吸管吸取悬液。）
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土壤中细菌、真菌呼吸作用强度的测定
参考文献：胡开辉主编微生物学试验中国林业出版社//2004年8月。
1.原理：
在一定容器中用一定浓度的碱液吸收因土壤呼吸作用所释放的二氧化碳，然后用标准酸回滴甚于的碱，求出用于吸收二氧化碳消耗的碱量。
由此计算出二氧化碳的释放量。
根据抗生素抑制某些类群微生物生长的特点，使用抗生素处理土壤能够把土壤呼吸中属于细菌和属于真菌的作用部分区分开来，分别进行测定。
2.器材：
2.1待检土样：鲜土
2.2器材：0.1mol/L NaOH溶液，0.1mol/LHCl溶液，10mol/L酚酞乙醇溶液，链霉素硫酸盐，放线菌酮，500mL广口瓶、纱布、线绳、酸碱滴定仪、电子称。
3操作步骤
3.1样品处理：取500mL广口瓶4个，每瓶盛20ml0.1 mol/L NaOH溶液.然后称取20g鲜土3份（内各加0.1g葡萄糖）。
其中1份加链霉素硫酸盐2万单位，另1份加放线菌酮4万单位，混匀。
3份土样均用双层纱布包好，悬于500ml广口瓶中，塞紧瓶塞，做好标记。
不加土壤样品的广口瓶作为空白对照。
然后置广口瓶于28℃温度下培养24h。
3.2酸滴定：小心取出广口瓶中土壤样品，于每瓶碱液中滴数滴酚酞指示剂，观察瓶中NaOH 溶液色变化并纪录，。
然后用0.1mol/LHCl溶液滴定NaOH溶液，至酚酞指示剂颜色消失，并纪录所用HCl数量。
3.3土壤含水量测定：
水分%=水分/干土重×100
干土%（水分系数）=1/1-水分%
3.4计算：
按滴定空白对照与个处理所消耗的盐酸数量之差，以及各处理中有等量的NaOH用于吸收土壤呼吸作用所释放的二氧化碳。
按每消耗1ml0.1mol/LnaOH相当于2.2mg二氧化碳量，计算出各处理土壤呼吸作用的二氧化碳释放量。
计算公式：
总呼吸强度：（CO 2mg/g干土）=B-A/20×干土%
细菌呼吸强度：（CO 2mg/g干土）=B-C/20×干土%
真菌呼吸强度：（CO 2mg/g干土）=B-D/20×干土%
试验报告：
土壤中细菌、真菌强度的测定结果。