免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白
免疫共沉淀
第十六章蛋白与蛋白相互作用分析第一节免疫共沉淀一．实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。
其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。
如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。
目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。
二．主要仪器和试剂1．主要仪器微量高速4°C离心机；vortex震荡器；垂直混和器；Western blot 所需仪器。
2．试剂（1）蛋白定量试剂盒；抗体；PBS；protein A/G agarose beads；（2）Western blot所需试剂（参考本书第十七章免疫印迹）；（3）NP-40蛋白裂解缓冲液（使用前加入蛋白酶抑制剂）：150mM NaCl，0.5% NP-40，50mM Tris-HCl。
配置500mL 需要：5M NaCl 15mL，10% NP-40 25mL，1M Tris-HCl （pH8.0）25mL。
三．实验步骤1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次(每次大约30sec)，4℃12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。
免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)解析
免疫共沉淀
(CO—immunoprecipitation)
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。 免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。
基本原理
细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物，若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 核苷酸序列。将中分离出cDNA克隆 。
实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适 量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 剩余裂解液加1μ g相应的抗体加入到细胞裂解 液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μ l protein A 琼脂糖珠，用适量 裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μ l protein A 琼脂糖 珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底； 将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液 洗3－4次；最后加入15μ l的2×SDS 上样缓冲 液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 仪分析。
解析免疫共沉淀(Co-IP)技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展
解析免疫共沉淀（Co-IP）技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展蛋白质是生物体内执行重要功能的基本分子。
它们通过相互作用形成复杂的网络，调控生物过程的发生与发展。
了解蛋白质相互作用对于揭示细胞的功能和疾病的机制至关重要。
免疫共沉淀（Co-IP）技术是一种常用的方法，通过该技术可以研究蛋白质之间的相互作用关系，并在生物药物领域取得了一系列突破性进展。
一、Co-IP技术的基本原理。
Co-IP技术基于免疫学原理，利用特异性抗体将目标蛋白质与其相互作用的伴侣蛋白质结合，并通过免疫沉淀的方式将复合物从细胞提取物中富集出来。
该技术的核心是选择合适的抗体，使其能够高效、特异性地结合目标蛋白质。
随后，通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最终得到目标蛋白质及其相互作用伴侣的复合物。
二、质谱技术在蛋白质片段表征中的应用。
质谱技术在蛋白质片段的表征中具有广泛的应用，它可以帮助我们确定蛋白质的氨基酸序列，识别和定量翻译后修饰，确定蛋白质的三维结构等。
这些信息对于理解生物药物的作用机制，评估药物的有效性和安全性，以及优化药物设计都具有重要的价值。
三、突破性进展：揭示蛋白质相互作用及生物药物研发。
Co-IP技术在蛋白质相互作用研究和生物药物研发中取得了重要突破。
以下是几个关键应用领域的例子：1.研究蛋白质复合物及信号通路：Co-IP技术可以帮助鉴定蛋白质复合物中的成员和相互作用方式，从而揭示细胞内复杂的信号通路网络。
例如，通过Co-IP技术，科学家们发现了许多关键的细胞信号通路，如MAPK和PI3K/Akt通路等，为深入理解这些通路的功能和调控机制提供了重要线索。
2.鉴定潜在药物靶点：利用Co-IP技术，研究人员可以筛选和鉴定与疾病相关的蛋白质相互作用伴侣，从而发现潜在的药物靶点。
这种方法在药物研发中具有重要的意义，可以加速新药的发现和开发过程。
3.生物药物研发：Co-IP技术在生物药物研发中的应用也非常广泛。
免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP
楼上说的准确的叫Co-IP。
IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。
而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP
楼上说的准确的叫Co-IP。
IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。
而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究共3篇
基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究共3篇基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究1蛋白质是生物体内许多重要化学反应和生命表现的基础物质，因此在生物医学、生命科学以及食品工业等领域中具有重要的应用价值。
然而，如何高效地检测蛋白质成为了研究人员关注的问题之一。
现代生命科学和医学研究中，蛋白质检测技术的发展起着决定性的作用。
传统的蛋白质检测方法在性能上存在一些问题，例如条件苛刻、过程繁琐等。
近年来，微流控芯片技术快速发展，为高灵敏度和快速检测蛋白质提供了新的可能性。
微流控芯片技术是一种将微流体学的概念应用于芯片技术中的新型技术。
由于其微小流通体积、高效率、快速响应和可重复性等特点，使得微流控芯片在生物医学和生命科学中得到广泛的应用。
与传统的检测技术相比，微流控芯片检测技术具有以下优点：①检测过程自动化，操作简便；②靶分子检测的容易性和高灵敏度；③减小样品消耗和反应污染的可能性；④实现多参数同时检测，提高检测速度和准确性。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术，是一种利用微流控芯片对微小的蛋白质样本进行高灵敏度快速检测的技术。
这种技术主要是基于特殊的仪器设备和芯片结构，以及一系列特殊的微流控芯片加工工艺和生物学方法。
相对于传统的蛋白质检测技术，该技术拥有以下优势。
首先，快速检测。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术采用微流控技术，可以将反应体积压缩到微米级别，缩短蛋白质检测时间，从而实现快速检测。
其次，高灵敏度。
由于微流控芯片的成像窗口积极利用了紫外线照射的特点，检出的灵敏度更高。
其次，自动化程度高，操作简单方便。
虽然微流控芯片的制作难度较大，但在实验室实验的过程中，操作简便、操作功效高，自动化程度也高。
最后，适用范围广。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术既可用于检测单一的样品，也可以同时检测多样品的蛋白质，适用于多种蛋白质检测。
微流控芯片技术是一项前沿技术，基于其原理的蛋白质检测技术也是一个充满挑战的研究领域，其复杂性主要表现在以下方面：首先掌握微流控芯片的设计与加工技术；其次，在芯片反应域内实现靶分子的高效捕获和分离；第三，在芯片上建立靶分子检测的体系，需要一系列特殊的生物学方法和技术手段。
染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用
遗传HEREDITAS Beijing 27 5 : 801 807 2005 技术与方法染色质免疫沉淀技术在研究DNA 与蛋白质相互作用中的应用1 1 1 2 1 王春雨石建党朱彦张琚 1. 南开大学分子生物学研究所教育部生物活性材料重点实验室天津300071 2. 美国塔芙茨大学医学院圣伊丽莎白医学中心心血管研究所分子生理学实验室波士顿马萨诸塞02135 2997 美国摘要: 在后基因组时代DN A 蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。
与其他方法相比染色质免疫沉淀技术chromat in immuno pr ecipitatio n assay ChIP 是一种在体内研究DN A 蛋白质相互作用的理想的方法。
近年来这种方法与DN A 芯片和分子克隆技术相结合可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DN A 靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况这将有助于深入理解DN A 蛋白质相互作用的调控网络。
总结了染色质免疫沉淀技术的方法特别介绍了使用这些方法取得的最新进展。
关键词: DN A 蛋白质相互作用染色质免疫沉淀技术ChIP DN A 芯片ChIP 克隆中图分类号: Q 78 文献标识码: A 文章编号: 0253- 9772 2005 05- 0801- 07 Application of Chromatin Immunoprecipitation Assay in Deciphering DNA Protein Interactions WANG Chun Yu1 SH I Jian Dang 1 ZH U Yan1 2 Z H ANG Ju 1 1. The Key La borat ory of Bioactive Mat erials Minist ry of Educat ion Ins titute for Molecular Biology Nankai Universit y Tianjin 300071 China 2. Laboratory of Molecula r Physiology Division of Cardiovas cular Res earch St . Eliza bet h s Medica l Center Tufts Univers ity S chool of Medicine Bost on MA 02135 2997 US A Abst ract : In the post genomic era identifyi ng and characterizing vari ous DNA protein inter actions are a major chal lenge in the research of gene tr anscripti onal regulation. Although many techni ques can be used for thi s purpose chr o matin immunopreci pitation assay ChIP by contrast is ideally suited for studyi ng DNA protein interactions in v ivo . In recent years standard ChIP assay has been modi fied to uncover some known factors unknown target sequences es pecial ly when combined wi th DNA microarray and molecular cloni ng strategi es. These hi gh throughput ChIP assays are more and more used to reveal the di stributi on profile of trans acti ng factor binding si tes throughout the genome which may yield many new insights into the DNA protein interaction network. This article summarized the methods of ChIP as say and highl ighted recent progress in the appli cation of this technique. Key words: DNA pr otein i nteractions chromati n immunoprecipitati on assay ChIP DNA micr oarr ay ChIP cl oning收稿日期: 2004 07 08 修回日期: 2004 08 04基金项目: 国家自然科学基金资助项目编号: 30471733 30271297 和留学人员短期回国工作讲学项目两个基地项目编号: 30410403237 2002 年度高等学校博士学科点专项科研基金编号: 20020055026 Supported by National Natural Sciences Foundat ion of China No. 30471733 30271297 Fund for Chinese Scholars Abroad to Work and Lecture in China Two Base Project No. 30410403237 and Spe o. cialized Research Fund for t he Doctoral Program of Higher Educat ion N 20020055026 作者简介: 王春雨1979男天津市人博士研究生专业方向: 医学分子生物学。
免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白
（ ｅ ａｏａ ｒ ｏ Ｐｏ ｉ Ｃ ｅ ｉｒ ｎ ｅｅｏｍ ｎａ Ｂｏ ｇ ｆ ｔ ｅＥ ｕａ ｏ ｎｓ ｙｏ Ｃ ｉａ Ｋ ｙＬ ｂｒ ｏｙ ｆ ｒｔ ｎ ｈｍ ｓｙａｄＤ ｖｌ ｅｔｌ ｉｏｙｏ ａ ｄ ｃｔｎＭｉｉｒ ｆ ｈｎ ， ｔ ｅ ｔ ｐ ｌ Ｓｔ ｉ ｔ Ｄ ｐｒ ｎ ｏ ｉｃｅ ｉ ｒ ａ ｄＭ ｌｃｌｒ ｉｌ ｙ ｏ ｅｅｏ ｉ ｃ ｎｅ ｕ ａ ｏｍ ｌ ｎｖｒｔ， ｈｎｓａ １０ １ Ｃ ｉａ ｅ ａｔ ｔ ｆ ｏｈｍ ｓｙ ｎ ｏｅｕ ｏ ｇ ，Ｃ ｌ ｇ ｆ ｆ Ｓ ｉ ｃ ，Ｈ ｎ ｎＮ ｒ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｃ ａｇｈ ０ ８ ， ｈｎ ） ｍｅ Ｂ ｔ ａＢ ｏ ｌ Ｌｅ ｅ ｅｉ ４
Ｌ 青霉素和 １０ｍ ／ ０ ｇＬ链霉素） ３ 、 于 ７ｑ 体积分数为 ５ Ｃ ：９ ％相对湿度培养箱进行培养 ， Ｃ ％ Ｏ 、０ 生长至对数期 时进行传代 ； 细胞达到所需数量 ， 并为对数期时， 收集细胞并计数． １２２ 细胞 全蛋 白提取 收对 数 生长期 的 Ｎ ｅａ ．． Ｔｒ一 ２细胞 （０ｃ 皿 ） 加 ２ｍ Ｂ １ ｍ ， ＬＰ Ｓ洗 １ ． 交联 剂 Ｄ Ｐ 遍 ４ｍｇ Ｓ／ ４ ０ ＬＤ Ｏ＋ ＬＰ Ｓ皿 ， ０ ＭＳ ８ｍ Ｂ ／ 交联 ３ ｉ． Ｂ 洗 １ ，０ Ｌ１ｍｏ ＬＴｉＣ Ｈ７５ 终 浓度 ２ ｍ ｌＬ ０ｍｎ Ｐ Ｓ 遍 ２０Ｉ ｘ ｌ ｒ－１ ． （ ｆ ｓ Ｐ ５ｉ ｏ ） ￣ ／ ＋ Ｂ ／Ｉ 处 理 １ ｉ．Ｐ Ｓ洗 １ ， 细 胞 刮 子 收 细胞 到 Ｅ ８ｍＬＰ Ｓ Ｊ． Ｉ ］ ５ｍｎ Ｂ 遍 用 Ｐ管 中． ０ ， ５ ０ ｇ ４℃离 心 ３ ｍ ｎ 去 上 清． ｉ， ＲＰ ０ Ｌ／ １ １０× ｏｋａ 蛋 白酶抑制 剂稀 释到 １ 即 ９ Ｌ 皿 ， ＩＡ ９ ０ ．． ０ ｃｃ ｔｉ ｍ， ｌ Ｘ， ／ 冰上 裂解 ３ ｉ ， ２０ ０ ｒｍ ｎ４℃ ０ ｍ ｎ １ ０ ／ ｉ
实验入门之---免疫共沉淀（Co-IP）
实验入门之---免疫共沉淀（Co-IP）小编最近挺忙的，实验室各种事情要做，读研的都知道，就不多加唠叨了，研究做机制的，肯定会做到蛋白与蛋白之间的结合伴侣情况，转录激活功能等等，首先讲结合蛋白，就要涉及到免疫共测定实验。
好吧不多说了，上干货。
原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用，为研究蛋白质相互作用的方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用prorein A预先结合在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否结合。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中。
4. 4℃，12000g离心15-30min，立即将上清转移到新的离心管中。
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗3-4遍珠子，然后用PBS 配制成50%浓度。
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。
在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。
但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。
（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。
但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。
若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
ip免疫共沉淀实验原理
ip免疫共沉淀实验原理ip（免疫沉淀）技术是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，其原理是利用抗体的高度特异性与特定蛋白质结合，然后通过共沉淀的方式将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同提取出来。
ip免疫共沉淀则是在ip技术的基础上，引入了免疫标记的抗体，使得目标蛋白质可以通过免疫标记被特异性地检测和纯化。
ip免疫共沉淀实验的基本原理是将抗体与靶蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，通过特异性抗体对抗原-抗体复合物进行识别，进而选择性地沉淀出目标蛋白质及其相互作用的蛋白质。
在该实验中，可以使用多种方法将抗原-抗体复合物与固相介质结合，如使用蛋白A/G琼脂糖、磁珠或微球等。
此外，还可以利用非特异性结合方式，如使用GST标签或His标签等。
ip免疫共沉淀实验的步骤一般包括样品制备、抗原-抗体结合、共沉淀、洗涤和分析等。
需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、组织提取物或包含特定蛋白质的纯化蛋白溶液。
样品制备的关键是要保持蛋白质的完整性和活性，并避免蛋白质的降解和氧化。
接下来，将合适的抗体与样品中的目标蛋白质结合。
这可以通过孵育样品与抗体一起在适当的条件下进行，使抗原-抗体复合物形成，并保持复合物的稳定性。
然后，将抗原-抗体复合物与固相介质结合。
这可以通过将固相介质与特异性结合抗体预先结合，使抗原-抗体复合物与固相介质结合。
固相介质的选择应根据实验需要和抗体的特异性来确定。
常用的固相介质包括蛋白A/G琼脂糖、磁珠或微球等。
固相介质的选择应使其具有高结合能力和良好的耐用性。
完成共沉淀步骤后，需要对固相介质进行洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
洗涤液的选择应遵循适当的条件，以确保蛋白质的特异性结合和洗涤效果。
将目标蛋白质从固相介质中洗脱，并进行进一步的分析。
洗脱的方法可以是热变性法、酸性洗脱法或其他适当的洗脱方法。
洗脱后的样品可以进行Western blot、质谱或其他分析方法，以检测和鉴定目标蛋白质及其相互作用的蛋白质。
浅析染色质免疫沉淀(ChIP)技术在DNA与蛋白质相互作用研究中的重要性
浅析染色质免疫沉淀（ChIP）技术在DNA与蛋白质相互作用研究中的重要性染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的一项强大技术，广泛用于多个领域的染色质相关蛋白的研究（如组蛋白及其异构体，转录因子等），特别适用于已知启动子序列或整个基因位点的组蛋白修饰分析研究。
这项技术采用特定抗体来富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，通过多种下游检测技术（定量PCR，芯片，测序等）来检测此富集片段的DNA序列。
ChIP技术自诞生之后，已成功的应用于人或动物细胞和组织[1] 、植物组织[2]、酵母[3] 以及细菌、质粒[4] 。
由于在信号转导和表观遗传研究中的突出作用，ChIP 在肿瘤[5-7]、神经科学[8-10]、植物发育[11-13] 等领域中应用非常广泛，同时有关细胞凋亡[14]、雌激素信号转导[15] 、胰岛素抵抗[16] 、组织发育[1]的文献中也用到ChIP。
目前，最常见的有以下两种ChIP实验技术：1. nChIP：用来研究DNA及高结合力蛋白，采用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）消化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于组蛋白及其异构体，例如[17-19] ；2. xChIP：用来研究DNA及低结合力蛋白，采用甲醛或紫外线进行DNA和蛋白交联，超声波片段化染色质，然后进行片段富集及后续分析，适用于多数非组蛋白的蛋白，例如[9, 15, 20]。
X-ChIP试验的一般过程以上两种方法在分离DNA-蛋白质复合物之后，对DNA进行PCR扩增，验证目标序列的存在。
除验证实验外，ChIP DNA也可以进行测序分析，这种方法被称为ChIP-seq[22]；也可做芯片分析，这种方法被称为ChIP on CHIP或ChIP-CHIP[23] 。
这两种方法都可用于分析感兴趣蛋白结合的未知序列，而不需要知道目标序列的详细信息，因此可以进行探索性的研究。
当需要对DNA结合的蛋白复合物（两个或两个以上蛋白共同结合在DNA上）进行研究时，可以采用reChIP技术对DNA蛋白复合物进行再次富集，从而分析两种蛋白同时结合的DNA片段，例如转录调控因子及其受体复合物[24]。
免疫共沉淀检测蛋白质间的相互作用
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的蛋白质相互作用分析技术，可以用于研究蛋白质之间的相互作用、识别蛋白质复合物以及探索细胞信号传导等重要生物学过程。
本文将详细介绍免疫共沉淀技术的原理、步骤和应用，并探讨其优点和局限性。
一、免疫共沉淀技术原理：免疫共沉淀技术基于抗体的高度特异性，利用抗体与靶蛋白质结合的能力，从复杂的蛋白质混合物中富集出靶蛋白质及其相互作用伙伴。
该技术主要分为两个步骤：1）抗体结合：将特异性抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物；2）沉淀：利用固相支持介质，如蛋白A/G琼脂糖或磁珠，将免疫复合物沉淀下来。
二、免疫共沉淀技术步骤：1. 样品制备：从细胞或组织中提取目标蛋白质，并加入破碎细胞溶液进行裂解，释放蛋白质。
同时，添加蛋白质抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保持蛋白质的完整性和稳定性。
2. 抗体结合：将特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
可以选择已经商业化的特异性抗体，也可以利用自制抗体。
3. 免疫共沉淀：将免疫复合物与固相支持介质（如蛋白A/G 琼脂糖或磁珠）结合，通过离心或磁力使免疫复合物沉淀下来。
4. 洗涤：通过多次洗涤步骤，去除非特异性结合的蛋白质和杂质，以提高目标蛋白质的纯度。
5. 脱附：使用适当的缓冲液脱附免疫复合物，使其从固相支持介质上解离出来。
6. 分析：通过Western blot、质谱等方法对脱附的免疫复合物进行进一步的分析和检测。
三、免疫共沉淀技术应用：1. 确定蛋白质间相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以识别和验证蛋白质之间的直接或间接相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装和功能等重要生物学过程。
2. 寻找潜在药物靶点：通过免疫共沉淀技术，可以筛选和发现与特定蛋白质相互作用的小分子化合物，为药物研发提供有力的靶点信息。
3. 验证蛋白质复合物：通过免疫共沉淀技术，可以确定已知蛋白质复合物的成员以及其相互作用方式，进一步了解复合物的结构和功能。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
4_生物大分子相互作用分析技术
4_生物大分子相互作用分析技术生物大分子相互作用分析技术是一种用于研究生物大分子（如蛋白质、核酸等）相互作用的实验技术。
这些相互作用在生物体内起着关键的生理功能，包括信号传导、代谢调节、细胞凋亡等。
因此，研究这些相互作用对于理解生物体内的生物过程以及疾病的发生机制具有重要意义。
下面将介绍几种常见的生物大分子相互作用分析技术。
一、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）免疫共沉淀是一种经典的生物大分子相互作用分析技术，主要用于检测蛋白质与其他生物分子（如蛋白质、核酸等）之间的相互作用。
该技术基于抗体的高专一性和亲和力，通过将要研究的蛋白质与特定抗体结合，然后利用这个抗体将目标蛋白质及其相互作用分子沉淀下来。
最后，通过Western blot等方法检测共沉淀样品中的相互作用分子。
免疫共沉淀技术已被广泛应用于研究蛋白质间的相互作用，例如信号通路中的蛋白质相互作用、蛋白质复合物的鉴定等。
二、蛋白质亲和纯化（Protein Affinity Purification）三、表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance）表面等离子体共振是一种利用金属表面等离子体共振现象研究生物大分子相互作用的实验技术。
该技术基于蛋白质与配体的结合可以改变金属表面的折射率引起共振波长的变化，通过监测这一共振波长变化得出生物分子相互作用的结果。
表面等离子体共振技术可以实时监测生物分子的结合动力学、测定亲合力常数等，因此被广泛应用于研究蛋白质与配体之间的相互作用和药物筛选等领域。
四、双杂交（Yeast Two-Hybrid）双杂交技术是一种用于研究蛋白质相互作用的方法。
该技术是基于酵母细胞内的转录激活子和DNA结合结构域的可分离性。
通过将要研究的两个蛋白质分别与转录激活子和DNA结合结构域融合，然后将这两个蛋白质结合到一起，重组构成转录激活子，从而诱导报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平，可以推断两个蛋白质是否发生相互作用。
免疫共沉淀验证蛋白相互作用的原理
免疫共沉淀验证蛋白相互作用的原理今天来聊聊免疫共沉淀验证蛋白相互作用的原理。
我最开始接触这个概念的时候，真是感觉一头雾水。
那时候就想啊，这玩意儿怎么就能验证蛋白之间相互作用呢？这就好比我们要在人群里找出相互认识并且关系很好的小团体一样。
免疫共沉淀的一个基础概念就是抗原- 抗体的特异性结合。
咱们生活中经常会用到锁和钥匙来比喻这个，钥匙（抗体）只能开特定的锁（抗原），非常的专一。
在细胞这个大社会里面，蛋白质就像一个个形态各异、功能不同的居民。
免疫共沉淀呢，就像是一场“身份验证”游戏。
假设我们怀疑蛋白A和蛋白B有相互作用。
我们先把细胞里的各种蛋白都混合在一起，这就像是把一个城市里所有的人都集中到了广场上。
然后呢，我们加入针对蛋白A的特异性抗体，这抗体就像侦探一样，能够精准地找到蛋白A并抓住它，而如果蛋白A和蛋白B是好朋友（有相互作用），那么蛋白B这个时候就会跟着蛋白A一块被抓住（沉淀）。
说到这里，你可能会问，那怎么知道是不是真的沉淀下来了呢？这就要用到一些检测手段啦，比如说通过电泳之类的方法。
就像在刚说的人群里找出小团体后，要给这个小团体拍个照片（测量）来作记录。
有意思的是，在这个过程中，还需要考虑一些干扰因素。
就像在找人小团体的时候可能会受到环境的影响，比如周围太嘈杂（细胞内存在其他一些生物大分子可能的非特异性结合等情况），这会影响我们准确判断。
免疫共沉淀在实际中应用可广泛了，比如说在研究某种疾病相关的信号通路的时候，如果我们怀疑两种蛋白在这个疾病的发病机制中有相互协作的关系，就可以用这个方法来验证。
像在肿瘤研究中，很多蛋白之间通过相互作用来影响癌细胞的增殖、迁移等过程，免疫共沉淀就能帮我们确定哪些蛋白是互相勾结（相互作用）的坏家伙。
不过老实说，我一开始也不明白它为啥能够那么准确地判断蛋白相互作用。
后来学习得多了，才慢慢理解还有很多相关的理论知识在背后支撑。
比如蛋白在细胞里的定位，如果两个蛋白在细胞中根本就不在一个可以碰头的地方（不同的细胞器等），那很可能就不存在相互作用，这也是我们在做免疫共沉淀前需要考虑的事情。
免疫共沉淀联合质谱分析筛选与HCMV IE86相互作用蛋白
免疫共沉淀联合质谱分析筛选与HCMV IE86相互作用蛋白李朝华;胡明;钱冬萌;王斌【期刊名称】《青岛大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(054)001【摘要】目的利用免疫共沉淀联合质谱分析的方法,在人胚肺成纤维细胞系MRC-5细胞和胶质瘤细胞系U87MG细胞中,筛选与人巨细胞病毒（HCMV）即刻早期蛋白IE86相互作用的病毒蛋白和剪接相关蛋白。
方法通过HCMV感染细胞使IE86蛋白在细胞中表达,采用免疫共沉淀的方法富集两种细胞系中的IE86结合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分离免疫共沉淀复合物,从胶中切取IE86结合蛋白条带,胶内酶解后进行液相色谱-质谱联用分析及数据库检索,筛选与IE86相互作用蛋白。
结果利用免疫共沉淀联合质谱分析,在MRC-5细胞中,共鉴定到与IE86相互作用的病毒编码的蛋白质17种,宿主细胞编码的剪接相关蛋白25种;在U87MG细胞中,共鉴定到病毒编码的蛋白质4种,宿主细胞编码的剪接相关蛋白8种。
结论与胶质瘤细胞系U87MG相比,人胚肺成纤维细胞MRC-5中有更多种病毒蛋白及剪接相关蛋白与IE86有相互作用,协同参与IE86的剪接及病毒早、晚期蛋白的表达,这为进一步研究HCMV在不同细胞环境中的复制机制提供了基础。
【总页数】6页(P1-5)【作者】李朝华;胡明;钱冬萌;王斌【作者单位】青岛大学基础医学院病原生物学系,山东青岛266071;青岛大学基础医学院病原生物学系,山东青岛266071;青岛大学基础医学院病原生物学系,山东青岛266071;青岛大学基础医学院病原生物学系,山东青岛266071【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.亲和纯化技术联合质谱分析筛选乳腺癌中p90核糖体S6蛋白激酶4相互作用蛋白 [J], 刘日强;刘天华;张钦乐;江凯;郭坤;张舒;刘银坤;杨华伟2.免疫共沉淀联合质谱分析筛选克罗恩病中Intelectin-1相互作用蛋白的初步研究[J], 顾问;周郑;吴文涌;刘晓昌;余昌俊3.免疫共沉淀结合质谱分析筛选HMGB4相互作用蛋白 [J], 王成;赵晓蒙;帅勇;李晓峰;刘喜枝;张晓婷;周畅4.免疫共沉淀联合质谱分析筛选结直肠癌组织中GPAA1相互作用蛋白的初步研究[J], 陈光;李世拥;安萍;蔡慧云5.免疫共沉淀联合质谱技术筛选柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3互作蛋白 [J], 赵焕之;赵其平;朱顺海;王璐;刘桂玲;李志行;董辉;黄兵;韩红玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Abstract To further elucidate the biological characteristics and the roles of guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 ( GBLP) in response to propranolol ( PRO) ,co2immunoprecipitation and HPLC2CHIP2IT2 MSΠMS were used to screen and identity the GBLP interacting proteins in human umbilical vein endothelial cells. Seven proteins were shown to interact with GBLP , including casein α2S1 , casein α2S2 ,β casein , desmoglein 1 precursor α, 2enolase ,fructose2bisphosphate aldolase C and peroxiredoxin 2. These proteins actively involved in energy metabolism of the cell , suggesting that GBLP might participated in the regulation of antioxidation processes ,which correlated with the known biological functions of PRO. Key words propranolol ; human umbilical vein endothelial cell ; guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP ; co2immunoprecipitation
邱 峰1) , 毛小琴2) , 陈世知3) , 邱宗荫4) 3 , 贾雄飞5)
(1) 重庆医科大学附属第一医院 ,重庆 400016 ; 2) 云南省第一人民医院 ,昆明 650032 ;3) 重庆医科大学附属第二医院 ,
重庆 400010 ; 4) 重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室 ,重庆 400016 ;5) 解放军昆明总医院 ,昆明 650032)
体 1 (receptor of activated protein kinase C 1 ,RACK1) ,
收稿日期 : 2008208221 ; 接受日期 : 2008211205 重庆市自然科学基金项目 (No. CSTC22005BB5227) 3 联系人 Tel : 023268485727 ,E2mail : zongyin @gmail . com Received : August 21 ,2008 ;Accepted : November 5 ,2008 Supported by Natural Science Foundation of Chongqing ( No. CSTC2 2005BB5227) 3 Corresponding author Tel : (023) 68485727 E2mail : zongyin. cn @gmail . com
本研究分别用 PRO 对映异体作用于 HUVEC ,采 用蛋白质免疫印迹法 (Western 印迹) 、激光共聚焦扫 描显 微 镜 技 术 ( laser scanning confocal microscope , LSCM) 比较分析细胞内 GBLP 的表达情况和定位 ,再 以免疫共沉淀法 (co2immunoprecipitation) 和高效液相 色谱2芯片2离子阱串联质谱系统 ( HPLC2CHIP2IT2MSΠ MS) 筛选 、鉴定 HUVEC 中的 GBLP 相互作用蛋白. 希 望通过本研究 ,进一步了解 GBLP 的功能 ,以及在 PRO 生物学效应及立体选择性机制中的作用.
SDS2PAGE 垂 直 电 泳 槽 (Bio2Rad 公 司) 、EDAS 290 扫描仪 ( Kodak 公司) 、激光共聚焦扫描显微镜 (TCS 公司) 、高速冷冻离心机 (德国 Heraeus 公司) 、
DYCZ224D 垂直电泳槽 ( 北京六一仪 器 厂) 、HPLC2 CHIPΠMS、HPLC2CHIP ( Agilent 1100 Series HPLC systems) 、Ion Trap LCΠMSD trap 6300 质谱仪 (Agilent
ISSN 100727626 CN 1123870ΠQ
·技术与方法·
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2009 年 3 月 25 (3) :276～281
免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选 GBLP 相互作用蛋白
Technologies) . 112 细胞培养
HUVEC 细 胞 株 培 养 于 含 10 %新 生 牛 血 清 的 RPMI21640 培养基 ,生长至对数期时进行传代 ;细胞 达到所需数量 ,并为对数期时 ,将密度一致的细胞分 为 2 组 ,分别用 80μmolΠL R ( + ) 2PRO 和 S( - ) 2PRO 作用细胞 2 h 后 ,收集细胞并计数. 113 细胞内 GBLP 的表达情况及定位 11311 蛋白质免疫印迹法分析 以β微管蛋白为 矫正上样量的内参蛋白. 取等量分别经 R ( + ) ΠS ( - ) 2PRO 处理的 HUVEC 总蛋白 (25 g) ,12 % SDS2 PAGE 分离 ;分离后的蛋白质转移至 PVDF 膜 ,用 5 % 脱脂奶4 ℃封闭过夜 ;加入 1∶300 稀释兔抗人 GBLP 多抗与 1∶5 000稀释兔抗人β微管蛋白单抗 ,室温孵 育 1 h ;加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG(1∶5 000) ,室温 孵育 1 h ; PBS 洗涤后 ,用化学发光法 ( ECL) 进行显 色 , Kodak EDAS 290 扫描仪成像. 样品中目的蛋白相 对含量以 A 表示 (A = 目的蛋白带发光强度Π同泳道 内参蛋白带发光强度) ,并比较各样品中的目的蛋白 质表达丰度差异 ,同时进行 t 检验. 11312 激光共聚焦扫描显微镜技术分析 将对数 生长期的细胞贴壁爬片后 ,分别用 80μmolΠL R ( + ) ΠS( - ) 2PRO 作用细胞 2 h ;0101 molΠL PBS (pH 712) 洗涤爬片 ,并依次如下处理 :4 %多聚甲醛室温固定 细胞 20 min ,滴加正常兔血清封闭液 ,室温 20 min ; 滴加兔抗人 GBLP 多克隆抗体 (1 ∶400 PBS 稀释) , 4 ℃过夜 ;滴加 Cy3 标记羊抗兔 IgG ,室温 2 h ;水溶 性封片剂封片 ,LSCM 观察细胞内 GBLP 表达和定位 情况. 114 免疫共沉淀法试验 11411 蛋白质样品制备 收集对照组 、R ( + ) 2PRO 组和 S( - ) 2PRO 组的细胞各 1 ×107 个 , PBS 洗涤 2 次 ,加入 1 ml 细胞裂解液 ; 同时设置不加兔抗人 GBLP 多克隆抗体平行对照. 11412 去除非特异性结合 分别取 200μl 上述蛋 白样品 ,蛋白质量约为 500μg ,加入约 1μg 与免疫沉 淀所用 IgG 同种属的正常兔血清 IgG 和 20 μl 充分 重悬的蛋白 A2琼脂糖 ,4 ℃缓慢摇动 3 h ,2 500 rΠmin 离心 5 min ,取上清液备用. 11413 免疫共沉淀 取 014 μg 兔抗人 GBLP 多克 隆抗体加入上清液 ,4 ℃缓慢摇动过夜 ; 加入 20 μl
Screening of GBLP2interacting Proteins with Co2immunoprecipitation
and an Integrated Microfluidic System
QIU Feng1) , MAO Xiao2Qin2) , CHEN Shi2Zhi3) , QIU Zong2Yin4) 3 , J IA Xiong2Fei5)
在过去的工作中 ,我们采用比较蛋白质组学策 略研究了普萘洛尔 (propranolol , PRO) 对映异构体 R ( + ) ΠS ( - ) 2PRO 诱 导 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 ( human umbilical vein endothelial cell , HUVEC) 蛋白质表达谱 差异 ,在所鉴定出的差异表达蛋白质中 ,发现 G 蛋 白 β 亚 基 2 样 1 蛋 白 ( guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP) 在 R ( + ) 2PRO 干 预后 的 HUVEC 中 高 表 达[1] . GBLP 是 新 近 发 现 的 RACK家族成员之一 ,又称为活化的蛋白激酶 C 受
摘要 为了进一步阐明 G蛋白β亚基 2 样 1 蛋白 (guanine nucleotide2binding protein subunit beta 22like 1 , GBLP) 在普萘洛尔 (propranolol ,PRO) 生物学效应发生机制中的作用 ,采用免疫共沉淀法结合液相 色谱2芯片2离子阱串联质谱 ( HPLC2CHIP2IT2MSΠMS) 系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cell ,HUVEC) 中的 GBLP 相互作用蛋白. 结果表明 ,有 7 种蛋白与 GBLP 存在 相互作用 ,分别为酪蛋白α2S1 、酪蛋白α2S2 β、酪蛋白 、桥粒芯蛋白 1 前体 、α2烯醇化酶 、果糖二磷酸 醛缩酶 C、硫氧还原蛋白过氧化物酶 2. 这些蛋白的生物信息学检索结果提示 , GBLP 可能参与了细 胞的能量代谢调节和抗氧化机制 ,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关. 关键词 普萘洛尔 ; 人脐静脉内皮细胞 ; G蛋白β亚基 2 样 1 蛋白 ( GBLP) ; 免疫共沉淀 中图分类号 Q51 ;Q633