qPCR引物设计
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1. Primer blast – 引物设计及特异性检验工具
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ •整合了Primer3软件，再加上Blast进行引物特异性的验证
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附录5 - RT引物的选用
• GSP：常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩
增低丰度的转录本时是最好的。
• Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转
录本的逆转录；不适用于降解的RNA
2）Forward primer（注：下划线标记的部分和免去末端6个碱基的靶 miRNA序列同源） ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA
3）Reverse primer（注：序列固定） TGGTGTCGTGGAGTCG
4）Taqman MGB探针（下划线标记部分与miRNA末端序列互补） (6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB)
kb
kb
•使用Oligo-dT作为引物：扩增离3’端远近不同的片段，离3’越远扩增
越差
•必须使用[Oligo-dT+(N)9]
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附录6 – qPCR引物的验证结果示意
Experimental validation data
•amplification plots, dissociation curves •2% agarose gel analysis •sequencing and BLAST data （可选） •标准曲线-》扩增效率（可选）
子；
（3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右（确保探针先于 引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右）；
（4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使
是被切割下来还会存在淬灭作用；
（5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反 应
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范 围，则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
若有已知引物，可填 入，以测试特异性
针对sybr qPCR：产物大小 填100 to 200（最大不超过 300）
qPCR引物设计
应用类型
•绝对定量（Absolute Quantification） •‹相对定量（Relative Quantification） •‹microRNA研究（MicroRNA Research） •‹基因拷贝数变异（CNV Research） •‹基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）
附录3 - Taqman探针合成时注意事项
（1）引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通
PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。
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PrimerBank – 结果
有些引物是附带了验证结果的
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3. miRNA qPCR的引物设计（茎环引物法）
miRNA
RT primer
Step 1: Stem-loop RT
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miRNA qPCR的内参引物
•内参U6（Human/Mouse/Rat）的引物 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT
•注：U6不属于miRNA
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•2% Agarose Gel Image(Right: DNA ladder of 100bp, 200bp,
400bp, 800bp, 2000bp)
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附录4 - 逆转录方法的选择
• 逆转录方式 – 1-step (one tube) RT-PCR（病毒检测） ▪ cDNA合成与PCR同管进行 ▪ 快速、更少污染 ▪ 对于稍微有些降解的RNA检测灵敏度更高 – 2-step RT-PCR（基因水平变化） ▪ 一次cDNA可用于多次PCR
Detection of contaminating gDNA in the –RT control (dark blue line)
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防止基因组DNA污染的两种引物设计方法
•A • Primer spans an intron/exon boundary •B • Primer flank an intron
效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
（6）、引物之间的TM相差避免超过2℃；
（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；
（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；
（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
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miRNA qPCR引物数据库
数据库来源：
MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1351374/
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2. qPCR引物的网络数据库
PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). PrimerBank contains over 306,800 primers covering most known human and mouse genes. •http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
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Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种（ 可输入通用名，如 human/mouse/rat/ra bbit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同 （7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
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附录2 - Taqman探针及引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；
（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
附录1 - 染料法引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物
自身形成环状发卡结构； （3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子； （4）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （5）、典型的引物18到24个核苷长； （6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于
可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
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Primer blast
引物是否需跨不同Exon
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
miRNA qPCR的引物设计
以has-miR-16为例：
成熟miRNA序列（末端8个碱基用下划线标注） •has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
1）RT引物（注：5端为通用的Stem和 Loop序列，末位8个碱基和 miRNA末端序列互补） CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA
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Primer blast – 结果
基因的Exon位置
引物的位置
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Primer blast – 结果
•引物的基本情况 •引物和非相关产物的配对情况
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基因组DNA干扰的判别
•+RT
•–RT
•+RT •–RT
Байду номын сангаас
•No template
•control
No gDNA detected in the –RT control (flat green/red line)
no gDNA removal
cDNA Forward primer
Step 2:
Real-time PCR
成分： 1. 茎环RT引物 2. 正向引物 3. 反向引物（通用） 4. TaqMan探针（可选）
Q
F Reverse
TaqMan probe primer
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• 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。
2-step Real-time RT-PCR的逆转录引物选择
(A)n
•(N)
9
• OligodT+(N)9
•OligodT
•Oligo-dT
• Oligo-
•(N)
dT+(N)9
9
•Amplicon – 3‘-end: 6
•Amplicon – 3‘-end: 2
1. Primer blast – 引物设计及特异性检验工具
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ •整合了Primer3软件，再加上Blast进行引物特异性的验证
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附录5 - RT引物的选用
• GSP：常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩
增低丰度的转录本时是最好的。
• Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转
录本的逆转录；不适用于降解的RNA
2）Forward primer（注：下划线标记的部分和免去末端6个碱基的靶 miRNA序列同源） ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA
3）Reverse primer（注：序列固定） TGGTGTCGTGGAGTCG
4）Taqman MGB探针（下划线标记部分与miRNA末端序列互补） (6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB)
kb
kb
•使用Oligo-dT作为引物：扩增离3’端远近不同的片段，离3’越远扩增
越差
•必须使用[Oligo-dT+(N)9]
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附录6 – qPCR引物的验证结果示意
Experimental validation data
•amplification plots, dissociation curves •2% agarose gel analysis •sequencing and BLAST data （可选） •标准曲线-》扩增效率（可选）
子；
（3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右（确保探针先于 引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右）；
（4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使
是被切割下来还会存在淬灭作用；
（5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反 应
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范 围，则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
若有已知引物，可填 入，以测试特异性
针对sybr qPCR：产物大小 填100 to 200（最大不超过 300）
qPCR引物设计
应用类型
•绝对定量（Absolute Quantification） •‹相对定量（Relative Quantification） •‹microRNA研究（MicroRNA Research） •‹基因拷贝数变异（CNV Research） •‹基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）
附录3 - Taqman探针合成时注意事项
（1）引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通
PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。
•Novobio Proprietary & Confidential
PrimerBank – 结果
有些引物是附带了验证结果的
•Novobio Proprietary & Confidential
3. miRNA qPCR的引物设计（茎环引物法）
miRNA
RT primer
Step 1: Stem-loop RT
•Novobio Proprietary & Confidential
miRNA qPCR的内参引物
•内参U6（Human/Mouse/Rat）的引物 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT
•注：U6不属于miRNA
•Novobio Proprietary & Confidential
•2% Agarose Gel Image(Right: DNA ladder of 100bp, 200bp,
400bp, 800bp, 2000bp)
•Novobio Proprietary & Confidential
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附录4 - 逆转录方法的选择
• 逆转录方式 – 1-step (one tube) RT-PCR（病毒检测） ▪ cDNA合成与PCR同管进行 ▪ 快速、更少污染 ▪ 对于稍微有些降解的RNA检测灵敏度更高 – 2-step RT-PCR（基因水平变化） ▪ 一次cDNA可用于多次PCR
Detection of contaminating gDNA in the –RT control (dark blue line)
•Novobio Proprietary & Confidential
防止基因组DNA污染的两种引物设计方法
•A • Primer spans an intron/exon boundary •B • Primer flank an intron
效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
（6）、引物之间的TM相差避免超过2℃；
（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；
（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；
（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
•Novobio Proprietary & Confidential
miRNA qPCR引物数据库
数据库来源：
MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1351374/
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2. qPCR引物的网络数据库
PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). PrimerBank contains over 306,800 primers covering most known human and mouse genes. •http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
•Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种（ 可输入通用名，如 human/mouse/rat/ra bbit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同 （7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
•Novobio Proprietary & Confidential
附录2 - Taqman探针及引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；
（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
附录1 - 染料法引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物
自身形成环状发卡结构； （3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子； （4）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （5）、典型的引物18到24个核苷长； （6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于
可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
•Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast
引物是否需跨不同Exon
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
miRNA qPCR的引物设计
以has-miR-16为例：
成熟miRNA序列（末端8个碱基用下划线标注） •has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
1）RT引物（注：5端为通用的Stem和 Loop序列，末位8个碱基和 miRNA末端序列互补） CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA
•Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast – 结果
基因的Exon位置
引物的位置
•Novobio Proprietary & Confidential
Primer blast – 结果
•引物的基本情况 •引物和非相关产物的配对情况
•Novobio Proprietary & Confidential
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基因组DNA干扰的判别
•+RT
•–RT
•+RT •–RT
Байду номын сангаас
•No template
•control
No gDNA detected in the –RT control (flat green/red line)
no gDNA removal
cDNA Forward primer
Step 2:
Real-time PCR
成分： 1. 茎环RT引物 2. 正向引物 3. 反向引物（通用） 4. TaqMan探针（可选）
Q
F Reverse
TaqMan probe primer
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• 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。
2-step Real-time RT-PCR的逆转录引物选择
(A)n
•(N)
9
• OligodT+(N)9
•OligodT
•Oligo-dT
• Oligo-
•(N)
dT+(N)9
9
•Amplicon – 3‘-end: 6
•Amplicon – 3‘-end: 2