细胞核与线粒体分离纯化

细胞核和线粒体的分离和观察课件

细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚细胞结构，由核膜、核仁和染色质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种利用连续的密度梯度介质对细胞进行分离的方法。
02
在密度梯度离心法中，细胞悬浮在密度梯度介质中，然后在离心机中旋转。
03
由于不同细胞组分的密度不同，它们在介质中沉降的速度也不同，从而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结构。

线粒体研究思路及方法

线粒体研究思路及方法1.引言1.1 概述线粒体是细胞中的一个重要细胞器，它是细胞内的“动力中心”，对于维持细胞的正常功能起着至关重要的作用。

随着科学技术的不断进步，对线粒体的研究也日趋深入。

了解线粒体的研究思路和方法对于揭示其功能、生理和病理过程具有重要意义。

线粒体的研究思路主要包括传统的研究思路和新兴的研究思路。

传统的研究思路主要依赖于细胞学、遗传学和生物化学等基础科学的方法和技术，通过对线粒体的形态、结构和功能进行观察和分析，来揭示其在细胞代谢、能量供应和细胞信号传导等方面的作用机制。

然而，传统方法存在着技术手段有限、观察分析精度不高等缺点，难以全面深入地研究线粒体。

随着新兴技术的发展，包括基因工程、蛋白质组学和转化技术在内的新方法和新工具为线粒体研究提供了更多的可能性。

通过基因工程技术可以对特定线粒体相关基因进行敲除、过表达、突变等处理，从而研究其对线粒体功能的影响。

蛋白质组学技术可以高通量地鉴定和定量线粒体蛋白，进一步揭示线粒体功能的组成和变化。

转化技术可以将外源基因导入线粒体，从而实现对线粒体的定位和操控。

除了研究思路的创新，线粒体的研究方法也在不断发展。

细胞培养方法可以提供大量的线粒体样本，为线粒体的研究提供了可靠的实验材料。

而分离纯化方法则可以将线粒体与其他细胞组分分离开来，方便对线粒体进行更深入的研究和分析。

综上所述，线粒体的研究思路和方法在不断地革新和发展中。

传统思路和新兴思路的结合，以及不断更新的研究方法为我们揭示线粒体的奥秘提供了更好的途径和手段。

未来的研究将继续深入探究线粒体的生理功能和相关疾病的发生机制，为健康和疾病治疗提供更有效的技术和策略。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构本文按照以下结构进行组织：引言、正文和结论。

引言部分分为概述、文章结构和目的。

正文分为线粒体研究思路和线粒体研究方法两个部分。

结论部分包括总结研究思路和展望未来研究方向。

单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法

单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法主要包括以下步骤：
1. 酶解：使用胶原酶和胰蛋白酶等酶将组织样本消化，将细胞间的连接分解，使细胞分散成单个细胞。

2. 离心：通过离心将单个细胞收集到管底部，形成细胞沉淀。

3. 洗涤：去除细胞沉淀中的组织残留物和杂质。

4. 重悬浮：将单个细胞重新悬浮在适量的缓冲液中，以便后续处理。

5. 过滤：通过过滤膜或滤器将细胞核与其他细胞成分分离，收集细胞核。

需要注意的是，上述步骤仅为一种参考方法，实际操作可能因实验条件、样本类型等因素而有所不同。

因此，在进行单细胞测序实验前，请详细阅读相关文献，了解并优化适合自己实验的细胞核分离和纯化方法。

同时，务必遵循实验室安全规范，确保实验过程的安全性。

细胞核和线粒体基因组的遗传和进化

细胞核和线粒体基因组的遗传和进化细胞核和线粒体基因组：两个不同的基因组生命的基础单位是细胞，而细胞内有两个不同基因组的存在，一个是位于细胞核中的核基因组，另一个是线粒体基因组。

它们分别控制着细胞内的不同生命功能。

细胞核基因组是由双亲遗传，而线粒体基因组则是由母亲遗传，这是两个基因组最显著的区别。

细胞核基因组细胞核中含有多个线状的染色体，其中编码蛋白质的基因数量一般为几千。

细胞核基因组是由父母双方遗传的，即50%的基因来自父亲，50%的基因来自母亲。

因此，每个孩子的细胞核基因组都是独特的，并且各有所不同。

细胞核基因组可以演化，基因突变、基因重组和自然选择等因素都会影响它的演化。

在基因突变中，DNA序列发生的变化会导致生物个体产生新的基因形态，这可能比原基因更适合生物个体生存和繁殖。

另一方面，通过基因重组，不同基因段之间的基因信息可以重新组合，在后代个体中产生新的基因形态。

在自然选择中，只有适应环境的基因才会在种群中传承下来，也就是说，在某个环境下，一些基因会比其他基因更适合和更有竞争力。

线粒体基因组线粒体基因组位于线粒体中，是由环状DNA组成的基因组，它编码了一些必需的生产线粒体酶的基因。

由于每个卵细胞含有许多线粒体，而精子中线粒体数量较少，因此线粒体基因组实际上是由母亲遗传给下一代的。

这个规则可以追踪到两亿年前的最近共同祖先，这个共同祖先是某种类群的起源。

线粒体基因组演化方式有所不同于细胞核基因组。

由于它的母系遗传，线粒体基因组的演化被称为“非混合性进化”，即同容海千万只，各自飞鸾赋。

它是借助随机突变的演化方式而增加多样性的。

线粒体基因组的有利变异，比如减少 DNA 损伤的功能会进行选择，而无害变异则会像逆境反应一样随机存在。

长期累积，一些变异可以累积为等位基因，形成不同的线粒体类型。

在人类和其他物种中，可以通过线粒体DNA分析来确定女性的家系，比如母系家谱、群体遗传关系和人口迁移等。

线粒体基因组的演化速率比细胞核基因组的演化速率快，这是由于线粒体基因组缺乏自我修复机制，而它的DNA又长期处于高能量衍射面或体内的氧化环境中。

线粒体dna分离试剂盒原理

线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体DNA（mtDNA）分离试剂盒是一种用于从细胞提取中分离纯化线粒体DNA的工具。

线粒体是细胞的能量产生中心，其DNA在许多生物学研究中具有重要作用。

分离线粒体DNA的原理基于细胞裂解、质粒DNA和细胞核DNA的去除，从而提取纯化的线粒体DNA。

该试剂盒通常包含以下主要组分：
1. 细胞裂解缓冲液：含有特殊成分，能够破坏细胞膜，释放细胞质和线粒体。

2. 离心管：用于离心样本，分离纯化的线粒体DNA。

3. 膜过滤器：对细胞裂解液进行过滤，去除细胞碎片和其他杂质。

4. 乙醇：用于沉淀线粒体DNA。

线粒体DNA分离试剂盒的操作步骤如下：
1. 将待分离线粒体DNA的细胞样本收集并进行离心，去除培养介质。

2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，将样本溶解，并破坏细胞膜，释放线粒体。

3. 通过离心步骤进行细胞碎片和大颗粒物质的去除。

将细胞裂解液转移到膜过
滤器中，离心滤去杂质。

4. 丢弃上清液，保留细胞裂解液中的纯化线粒体。

5. 加入乙醇，使线粒体DNA沉淀。

6. 进行离心步骤以沉淀线粒体DNA。

7. 弃上清液并使用适量的缓冲液洗涤线粒体DNA的沉淀物。

8. 最后，将纯化的线粒体DNA溶于适当的溶剂中，以备后续分子生物学研究
使用。

线粒体DNA分离试剂盒利用细胞裂解和离心技术，可以高效地提取纯化的线
粒体DNA，且能够去除细胞核DNA和其他污染物质。

这种纯化的线粒体DNA可
以用于许多应用，包括线粒体功能研究、群体遗传学、线粒体疾病相关研究等。

细胞核与线粒体的分离

2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心（Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。

实验一：线粒体和细胞核的制备与观察

染色
01
使用适当的染色剂（如甲基绿）对线粒体和细胞核进行染色，
以便在显微镜下观察。
显微观察
02
在显微镜下观察染色后的线粒体和细胞核，记录其形态、大小、
分布等信息。
图像分析
03
使用图像分析软件对显微镜下的图像进行处理和分析，提取有
关线粒体和细胞核的特征参数。
04
结果分析
线粒体和细胞核的形态特征分析
酶
用于消化细胞膜，使线粒体和细胞核更容易分离。
所需仪器
显微镜
用于观察分离的线粒体和细胞核。
移液器
用于精确移取试剂和细胞样品。
离心机
用于高速离心，分离细胞的不同组分。
恒温培养箱
用于保持细胞培养的温度恒定。
实验对象（细胞来源）
小鼠胚胎成纤维细胞
这些细胞易于培养，并且含有丰富的线粒体和细胞核，适合用于实验观察。
实验分析
通过实验结果分析，得出线粒体和细胞核在形态、大小、分布等方面的特征与它们的功能密切相关。
对实验的理解与思考
实验意义
本实验对于理解细胞结构和功能具有重要意义，特别是对于理解线粒体和细胞核在能量代谢、基因表达等方面的作用。
实验局限性
实验过程中可能存在一些误差和干扰因素，例如组织匀浆不充分、密度梯度离心条件不理想等。
实验一线粒体和细胞核的制备与观察
contents
目录
• 实验目的 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论
01
实验目的
理解线粒体和细胞核的功能
线粒体功能
线粒体是细胞内的能量工厂，负责氧化磷酸化，产生ATP，为细胞提供能量。
细胞核功能
细胞核是遗传信息的储存和调控中心，负责DNA的复制、转录和翻译，控制细胞的生命活动。

细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究

细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究一、引言在细胞内，细胞核和线粒体是两个重要的细胞器。

细胞核是细胞中的控制中心，包含着细胞的遗传信息，可以指导细胞的生长、分裂、分化等重要生命活动。

线粒体则是能量产生的地方，参与了细胞内ATP的合成过程，是细胞内的“动力站”。

两者的正常功能和相互协调，对于维持正常细胞代谢和生命活动至关重要。

本文将介绍细胞核和线粒体在细胞内融合和分裂的分子机制研究。

二、细胞核的融合和分裂1. 细胞核的融合细胞核融合是细胞内一种常见的现象，发生在不同细胞类型之间，也可以发生在同一细胞内。

细胞核融合的主要过程是两个细胞核的膜和核孔融合，形成一个新的细胞核。

细胞核融合在细胞分裂、配子的合并以及体细胞复制等过程中发挥着重要的作用。

在真菌细胞的生殖过程中，细胞核融合是必须的。

在两个不同的菌株交配时，两个不同的细胞核先互相识别，然后相互融合。

细菌的细胞核融合是直接发生的，而真核生物的细胞核融合则需要依赖线粒体的参与。

2. 细胞核的分裂细胞核的分裂是指一个已经融合的细胞核经过有序的分裂过程分成两个细胞核，从而实现细胞的分裂。

细胞核分裂是生物体中一个基本的生物学过程，也是细胞分裂分化和生殖的基础。

细胞核的分裂可分为有丝分裂和无丝分裂两种。

有丝分裂的发生需要依赖于微管的形成和变化，在一系列有序的过程中完成细胞核的分裂。

相比之下，无丝分裂过程则较为简单，亦适用于一些不具有微管的原核生物。

三、线粒体的融合和分裂1. 线粒体的融合由于线粒体在基因组、膜蛋白结构等方面的特殊性质，线粒体细胞质的融合通常只发生在特定的条件下。

线粒体融合经常发生在精子的入侵和受精卵的形成过程中。

在精子进入受精卵之后，会释放出线粒体DNA，该DNA被研究人员用来推断线粒体融合的过程，进一步证实了线粒体融合的存在。

2. 线粒体的分裂线粒体分裂是通过不同的机制进行的，分别是原代线粒体的分裂和线粒体DNA的复制和分配。

酵母中线粒体的分裂过程需要多种催化反应，包括酵母基因群中的一组B电子转移酶蛋白和PARP-1和脑钠素的介导反应等。

细胞核及线粒体的分级分离实验报告

细胞核及线粒体的分级分离实验报告下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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核酸提取原理及方法

核酸提取原理及方法核酸提取是从生物样品中分离纯化核酸的一种常用技术。

核酸提取的目的是获得高质量的DNA或RNA样品，这对于进行分子生物学实验、遗传分析和基因工程等研究都具有重要意义。

本文将介绍核酸提取的原理和常用的方法。

1.核酸提取的原理核酸提取的主要原理是利用核酸的生化性质和细胞膜结构的特点。

通常情况下，核酸存在于细胞核和线粒体中的DNA和细胞核和线粒体中的RNA两种形式。

核酸提取的基本步骤包括样品裂解、蛋白质沉淀、核酸溶解和纯化。

（1）样品裂解：样品裂解的目的是破坏细胞膜和胞壁，释放核酸。

裂解方法包括物理方法（如冻融、超声波等）和化学方法（如酶解、有机溶剂的应用等），具体选择方法应根据不同样品的特点而定。

（2）蛋白质沉淀：裂解样品中存在大量的蛋白质，在提取核酸前需要将蛋白质沉淀。

常用的方法有酚酸法和酚氯仿法。

酚酸法通过将样品加入等体积的酚酸混合液中，形成两相体系，蛋白质会沉淀到有机相中，然后通过旋转分离出蛋白质相。

酚氯仿法则是在酚酸法的基础上，加入氯仿与酚酸相分离，从而得到较纯的核酸。

（3）核酸溶解：蛋白质沉淀之后，需要将核酸从蛋白质中溶解出来。

一般可使用三氯化锂、氢氧化钠或磷酸缓冲液等。

（4）核酸纯化：核酸溶解之后，需要将其中的杂质（如酶、盐、聚合酶等）去除，获得纯化的核酸。

常用的方法有酒精沉淀法、硅胶柱法和磁珠法。

酒精沉淀法通过在核酸溶液中加入酒精，使核酸沉淀到底部。

硅胶柱法是利用硅胶的亲合性，将核酸吸附在硅胶柱上，然后经过一系列的洗脱步骤得到纯化的核酸。

磁珠法是利用磁性珠子的特性，在核酸样品中加入磁珠，通过磁力将磁珠聚集在一起，然后用洗涤缓冲液去除杂质，再用洗涤缓冲液洗脱核酸。

2.核酸提取的方法核酸提取的方法有很多种，以下介绍常用的几种方法。

（1）酚酸法：酚酸法是核酸提取的经典方法之一、该方法将样品裂解后，加入等体积的酚酸混合液，通过旋转离心沉淀蛋白质。

然后将上清液取出，加入异丙醇沉淀DNA或RNA，离心沉淀出核酸。

细胞实验教案1.

细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。

二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。

先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

高中生物实验二线粒体和细胞核的制备与观察

↓
↓
↓
沉淀（线粒体）上清液（制一张涂片③后弃去）
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
Байду номын сангаас
涂片方法示意图
4.4 分离物鉴定
▪ 细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40×）检查。
▪ 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学显微镜观察。
实验二线粒体和细胞核的制备与观察
1.实验目的
▪ 掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法。
▪ 掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
2.实验原理
1）分级差速离心 ▪ 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度
取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。 ▪ 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 ▪ 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液。
▪ 细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。
▪ 线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
口腔上皮生物细科学胞与教工的学程研系线究细室胞粒生物体学实分验布
6.注意事项
▪ 分离全过程要在0～4℃进行，如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。

细胞组分分级分离实验报告

细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。

常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。

⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。

细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。

詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。

实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。

如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。

注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。

4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。

6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。

实验六细胞器的分离与观察

0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、
甲基绿
Байду номын сангаас
-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离
（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
D 10000g x20min
E 105000g x120min
（2）离心：低温离心机中进行。每次离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平。第一次以600g离心10min。将其上清夜移入 Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待后面使用(分离线粒体)。沉淀使用1ml预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次 1000g离心10min。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速
（r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。
离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心

细胞核和线粒体的分离实验报告

细胞核和线粒体的分离实验报告实验五细胞核和线粒体的分离一、实验目的1、了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。

2、熟悉离心机、匀浆器的使用方法。

二、实验原理1、分离纯化的方法为了研究某种细胞器的结构、功能或制备某种生物大分子，常需要大量采集细胞的某些亚组分，因此，有必要分离细胞器。

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。

主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。

差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。

被分离的分子越小，需要的离心速度越高。

密度梯度离心：预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同梯度层内。

匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖溶液（0.25mol/L）。

它比较接近细胞质的分散相，具有足够的渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。

2、细胞器的鉴定细胞核——姬姆萨染液线粒体——詹纳斯绿 B詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。

线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

三、实验用品1、试剂:生理盐水、0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、1%詹纳斯绿B 染液、姬姆萨染液2、材料: 兔子肝脏3、器材：解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器4、设备：高速离心机四、实验步骤1、制备兔肝细胞匀浆：向兔血管注射空气针处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。

称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。

然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。

细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离

实验二细胞核，叶绿体，线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。

4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法。

二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

细胞组分的分离在等渗溶液（0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行。

●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞。

●在3000r/min的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。

●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。

三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶，洗净搽干后去除叶梗和粗脉，称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中，放入组织捣碎机(间歇)；低速匀浆1min；间歇匀浆。

2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。

3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离。

5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮。

（浓度不要太高，不利于观察）➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。

第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。

收集沉淀涂片，用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。

实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。