生物化学考研资料

第五章

蛋白质III：蛋白质的性质、分离与鉴定

第一节蛋白质性质

一、蛋白质的酸碱性质

蛋白质等电点（pI）

溶解度最小

二、蛋白质分子的大小

KD，kd，kD，kDa （kilodalton）

寡聚蛋白质（oligometric protein）

超分子复合物（supramolecular complex）

蛋白质分子量可粗略估计（AA平均分子量约为110 dalton）

三、蛋白质的胶体性质

质点范围：1-100 nm

蛋白质胶体系统稳定的原因：

水化层（hydration mantle）

双电层（electric double layer）

第二节蛋白质的分离纯化

一、蛋白质分离提纯的一般原则

高纯度、高活性、高回收率

二、蛋白质的分离方法

（一）根据分子大小不同的分离方法

1.透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）

半透膜（玻璃纸，火棉纸）

透析常用于蛋白质溶液的除盐

超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩

3.凝胶过滤（gel filtration chromatography）

分子筛层析，分子排阻层析

交联葡聚糖（Sephadex）

聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）

琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）

凝胶过滤原理

根据蛋白质分子大小用凝胶作为介质分离蛋白质的一种柱层析方法。

比凝胶网孔大的分子被排阻在凝胶颗粒外，而最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶颗粒的内外，洗脱路径长，因而得到分离。

（二）利用溶解度差别的分离方法

1. 等电点沉淀

2. 蛋白质的盐溶与盐析

3. 有机溶剂分离法

4. 温度对蛋白质溶解度的影响

（三）根据电荷不同的分离方法

1 电泳（electrophoresis）

在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度与蛋白质分子量、所带电荷及分子形状有关。

迁移率＝某一蛋白条带移动距离/前沿到达距离

a. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）丙烯酰胺和交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过硫酸铵催化下聚合而成。

可以控制孔径大小

b. 不连续电泳（discontinuous electrophoresis）

凝胶孔径（浓缩胶，分离胶）、缓冲液、pH

三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应

c. 毛细管电泳（capillary electrophoresis）

50 m内径

d. 等电聚焦电泳（IFE）

蛋白质在具有pH梯度的介质中进行分离。在电场中，每种蛋白质成分将移向并停留在等于其等电点的pH处，形成一个很窄的区带。

用途：按等电点分离蛋白质

鉴定蛋白质等电点

2.离子交换柱层析

（ion-exchange chromatography）

纤维素离子交换剂

阳离子交换剂: CM-Cellulose(羧甲基纤维素)

阴离子交换剂: DEAE-Cellulose

葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion exchanger）兼分子筛效应

（四）根据蛋白质的吸附特性分离

填料有：

羟基磷灰石、活性碳、硅胶、氧化铝等

（五）利用特异生物学亲和力纯化

利用蛋白质所具有的生物学特异性，通过与特异配基专一、可逆结合（非共价结合）分离蛋白质的一种层析方法。优点：高效、高纯

亲和层析（afinity chromatography）

快速蛋白液相层析

fast protein liguid chromatography(FPLC)

思考题

蛋白质胶体稳定性的原因

凝胶过滤、离子交换柱层析的原理

电泳原理

亲和层析、盐析

蛋白质分离可分别根据其、、、性质进行。

蛋白质在电泳胶上的迁移率与蛋白质分子、和有关。

不连续电泳分离效果好是因为它同时具有、、三个效应。

DEAE-cellulose 是一种。

蛋白质混合物经凝胶过滤后，大分子先于小分子被洗脱。（）

盐析和透析均可用于蛋白质除盐。（）

羧甲基纤维素属于阳离子交换剂。（）

第三节蛋白质的鉴定

一、蛋白质分子量的测定

（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS－PAGE

变性电泳

在巯基乙醇存在下，蛋白质亚基分开，多肽链伸展；然后SDS与多肽链以1.4:1的重量比结合成复合物。

SDS与蛋白质的结合改变了蛋白质分子的带电情况和分子形状

因此当蛋白质在电场中移动时，其迁移率仅与其分子量有关。

蛋白质分子量M与迁移率μ的关系式：

Log M = a - b μ

用已知分子量的标准蛋白在同样条件下电泳，分别测其迁移率，做成标准曲线。

测出未知蛋白质的迁移率，从图上查得蛋白质分子量。SDS-PAGE测定蛋白质分子量的特点：

蛋白质已变性；

对多亚基蛋白，测定的是亚基的分子量。

（二）凝胶过滤

蛋白质分子量与洗脱体积关系式：

Log M = k1-k2Ve

标准蛋白洗脱曲线

测出未知蛋白质的洗脱体积，从图上查出蛋白质分子量。特点：

测的是天然蛋白质分子量；

适合球状分子。

（三）沉降速度法

蛋白质在离心力作用下发生沉降，沉降速度与蛋白质分子分子量、密度、形状有关。

对特定蛋白质来讲，单位离心力场的沉降速度为一定值，称为沉降系数（sedimentation coefficient）。

沉降系数通常用Svedberg 单位（S）表示。

一个S等于10-13秒。

斯维得贝格（Svedberg）方程：

沉降系数越大

分子量越大。

（四）蛋白质分子量测定新技术

1. Recombinant DNA technology

2. Electrospray Mass Spectrometry

二、蛋白质纯度的鉴定

（一）电泳一条带

（二）沉降分析图谱一个峰

（三）溶解度曲线一个折点

（四）结晶

三、蛋白质含量的测定

1. 凯氏定氮法

2. 双缩脲法

3. Folin-酚法(Lowry法)

4. 考马斯亮蓝法

5. 紫外吸收法

四、蛋白质免疫印迹分析

（immunoblot，western blot）（一）原理

蛋白质的凝胶电泳分离；

抗原-抗体间的特异结合