细胞培养中常见问题及解决方案免疫学教研室李琦.ppt

冷冻方法
传统方法： 4℃ 10分钟→ -20℃ 30分钟→-80℃ 16-18小时
（或过夜）→液氮罐。
程序降温： 利来自百度文库等速降温机以-1～-3℃/分钟的速度由室温降
至-120℃后放入液氮罐中。
-70℃过夜后，移入液氮罐中。
细胞复苏的原则
快速融化 以避免冰晶重新结晶而对细胞造成的伤害导致 细胞死亡
对污染细胞的抢救
将细胞离心后用PBS液洗两遍，将细胞注入小鼠腹 腔，一周后无菌收集腹水细胞（或实体瘤细胞）。
黑胶虫污染
黑胶虫
黑胶虫是一种生物，直径小于0.1um （纳米细菌） 存在于血清中 生长缓慢，与细胞生长有此消彼长的关系
应对方法
更换血清 勤换液（贴壁细胞可用无菌PBS洗几遍，
悬浮细胞可加入小鼠腹腔巨噬细胞） 使用新的一次性塑料培养瓶
培养基 血清的筛选 其他(细胞生长刺激因子，饲养细胞）
培养基
pH 缓冲体系 水
缓冲体系
HEPES
是一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力。
其最大优点是在开放式培养或细胞观察时 能维持较恒定的PH值。
使用超纯水
血清
胎牛血清和新生（出生后24小时内未吸奶）的 小牛血清
批间差异很大
血清的筛选非常重要
血清的筛选
细胞培养法筛选 克隆化法筛选
杂交瘤细胞的克隆化
克隆化—即把培养孔中的细胞从单个细胞进 行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗 体达到均一性。
有限稀释法
濒临死亡细胞的挽救
生长状态不好，而又比较娇贵的细胞。加入细胞生 长因子（IL-6）
活细胞数量非常少的细胞， 移植于24孔培养板中，并加 入饲养细胞
常见的污染
细菌污染 真菌污染（霉菌、酵母菌） 支原体污染
72﹪持续使用抗生素培养的细胞有支原体感染
造成支原体高污染率的原因
支原体 size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般 过滤膜（0.22-0.45 um） 支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜 可观察到的特征变化 缺乏简单、快速且可靠的检测方式
细胞的交叉污染
不在同一超净台内同时进行不同细胞的操作 同时培养两种细胞时，所有物品应分开使用 重要细胞系的传代应有两人独立进行
警示！
污染的细胞必须经灭菌后，方可丢弃。
彻底消毒CO2孵箱。 查明污染原因后，再重新复苏细胞。
三. 细胞的冻存与复苏
细胞冻存的注意事项
及时、足量的冻存。 欲冻存的细胞应生长状态良好，存活率＞90﹪， 并有80-90﹪致密度，细胞数目应 ＞1-5×106/ml 冻存细胞应保证其特有的性质（如:是否有抗体产生） 注意冷冻保护剂的品质，DMSO应为试剂级等级
注意事项
提前做好准备工作及个人防护工作
取出冷冻管应立即放入37℃-42℃ 水槽中，轻摇冷冻管使其在1分钟 内全部融化
水槽液面不要高于或接近冻存管口， 以防污染
谢 谢！
预防与控制
设备方面：
1、使用已确定无支原体污染的细胞株 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染
之细胞 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面：定期以标准的支原体 检测方法检测细胞、
培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染
对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生
素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。
无 菌
生物污染 室内环境 操作过程 培养器皿及培养环境
化学污染
超净台
预滤网： 1-3个月换一次。
风速： 酒精灯放在超净台边，火焰向外。
高效过滤器：有无过期和破损，1-2年换一次。 定期用粒子检测仪检测，也可做细菌培养。
严格无菌操作
培养环境及培养器皿
化学污染
细胞培养器皿 化学试剂 蒸馏水
使用标准厂家的一次性或新的培养器皿 使用三蒸水 选高纯度的试剂（如RPMI1640中的NaHCO3)
细胞培养中常见问题及解决方案
单克隆抗体制备流程
英国牛津大学
澳大利亚纽卡绍尔大学
美国路德威格癌症研究所
一. 细胞养不好的原因及对策 二. 怎样预防和应对细胞培养中的污染问题 三. 细胞的冻存与复苏
一.细胞养不好的原因与对策
有没有污染？ 生长状态是否正常？ 是否需要换液补充营养？
动作要轻柔 大胆丢弃细胞，只留1/3或1/6最佳
饲养细胞（feeder cell）：
饲养细胞的作用： 增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对 细胞密度的要求 吞噬清除死亡的细胞 分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长
饲养细胞的种类和制备方法：
脾细胞的准备
拉颈处死小鼠 无菌操作取出脾脏 清洗、研磨 收集细胞 离心洗涤
二.怎样预防和应对细胞培养中的污染问题