单抗制备常见问题分析
抗体纯化常见问题回答
用户园地Q & A30鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体纯化提供很好的解决方案。
然而要得到高质量高纯度的抗体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。
1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，有哪些样品处理的方法？在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿命。
对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂蛋白，酚红，小分子污染物等等。
腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。
方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白。
很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。
酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。
对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。
最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。
更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。
2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG还是ProteinA？首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介质。
但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。
浅析单抗原液的生产工艺
浅析单抗原液的生产工艺单抗即单克隆抗体，是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。
单抗药物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及烈性传染病的防治领域有着突出的作用。
单抗都是采用哺乳动物细胞进行表达，主要以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）为主。
在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度以外，还需有效的灭活和清除病毒。
单抗原液车间生产的原液不适用热力灭菌工艺，通常选择无菌操作的非最终灭菌生产工艺。
单抗生产中病毒污染风险：CHO细胞系是制造许多治疗性蛋白质的主力。
CHO细胞的生物安全等级为一级，CHO本身存在内源性逆转录病毒，这是已经被证实了的，但这种病毒对人类不具有致病性。
从药物质量安全角度出发，遵循SFDA 公布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，加入病毒去除和灭活方法。
此外，基于哺乳动物细胞进行的培养发酵，产品被病毒污染是考虑的主要生产风险之一。
病毒污染的其他潜在来源可能还有：使用已经被污染了的主细胞种子库或工作细胞种子库；操作员可能带进病毒，污染工艺；细胞线残留上一级仍有活力的病毒。
因为哺乳动物细胞为带入的病毒污染物提供了合适的宿主细胞，因此病毒量可能会随着细胞培养而放大，进而可能增加生产过程的整体风险。
单克隆抗体药品生产通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、分析质控和制剂。
单抗的生产工艺：单抗原液的生产工艺主要概括为两个阶段：上游细胞的培养、发酵和下游的纯化。
细胞种子经摇瓶、WAVE反应器、一、二、三级种子培养扩增后进入发酵罐进行发酵培养。
发酵结束后经离心机进入下游进行纯化。
离心后的料液经过层析、超滤后变成原液。
具体的工艺流程描述如下：（1）细胞复苏：细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
（2）细胞传代培养：①悬浮细胞培养：是指细胞在培养液中呈悬浮状态进行生长繁殖，能连续培养和连续收获的培养技术。
抗体亚型鉴定常见问题解析
抗体亚型鉴定常见问题解析一、单抗亚型鉴定(亚型,单抗,腹水,阳性克隆)筛选出阳性克隆后，制备了腹水，可是鉴定亚型的时候，发现亚型不纯，有好几种，不知道是什么原因。
亚型鉴定选用的是SBA的亚型分选试剂盒。
腹水没有纯化，离心后直接测得。
请大家帮我分析一下是什么原因？答：你要测亚型必须用细胞培养上清或者是纯化后的抗体，绝对不能用腹水：腹水的成分很杂，包含小鼠本身的IgG。
另外还有可能是你的细胞株本身就不是单克隆，SBA的亚型试剂盒我没有用过，我用过sigma的是ELisa方法测定亚型，很不好用。
用serotec试纸条或bethly免疫扩散效果很好；HBT的试纸条也不错，操作简单，2-3小时搞定，推荐用细胞上清来检测，不易出现多亚型误检。
缺点是价格偏高；谢谢了。
从大家的分析来看亚型不纯由以下原因产生：1.腹水需要纯化后再测亚型。
2.单克隆筛选不纯。
二、单抗亚型鉴定为何全部是IgM在小鼠免疫阶段，是按照经典方法进行免疫的：经过基础免疫，三次加强免疫（间隔三周），小鼠效价达到1：12800以上，末次冲击免疫三天后，取脾细胞与SP2/0细胞融合，然后根据间接ELISA检测效价上清结果和有限稀释法进行筛选和亚克隆，其中的酶标二抗用的是辣根酶标记的羊抗鼠IgG（Fc片段），三轮亚克隆后得到五铢全阳株，可是经过取他们的细胞上清进行亚型鉴定结果全是IgM。
并且最近师兄们做的其他抗原筛选到的单抗，经过腹水鉴定也全是IgM。
不知道原因何在。
请院子里的战友指点迷津：1.在制备单抗过程中，如何能最大限度的制得IgG型单抗，影响其为IgM的因素都有哪些？？如果说免疫方法和筛选阶段所用的酶标二抗有最大影响的话：我上面的免疫程序和用的酶标二抗都是朝着IgG而设计的。
2.在进行亚型鉴定过程中，在对单抗株细胞上清进行浓缩的时候，会不会也将细胞上清中的小牛血清也进行了同等的浓缩，10% 的小牛血清和1～5mg/L的单抗浓度相比，在鉴定亚型过程中有没有可能只是鉴定出来了小牛血清中的各种抗体亚型？？3.能否请有志之士给出亚型鉴定两种方法（ELISA和免疫双扩）的详细步骤（经过实践证明了得，可行的）？？例如：在免疫双扩的时候上清中抗体浓度应该在什么范围之内？？而腹水浓度又应该设在什么范围之内？？4.请大家给推荐几个性价比高的鉴定亚型的试剂盒。
WB问题分析
WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。
在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高:1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
单抗配制过程护士要注意事项_概述说明
单抗配制过程护士要注意事项概述说明1. 引言1.1 概述本文旨在概述单抗配制过程中护士需要注意的事项。
随着单克隆抗体治疗的普及，单抗配制成为了临床工作中不可或缺的环节。
正确而规范地完成单抗配制过程对于确保治疗效果、保证患者安全至关重要。
因此，本文将介绍在单抗配制过程中，护士应该关注和遵循的几个主要方面。
1.2 文章结构本文按以下几个部分进行阐述：引言、单抗配制过程护士要注意事项、警示和风险提示、术语解释与常见问题解答以及结论。
通过这些部分的详细介绍，读者将能够全面了解在单抗配制过程中所需遵循的步骤、注意事项和相关知识。
1.3 目的本文旨在提供给从事临床工作的医务人员参考，特别是与单克隆抗体治疗有关的护士。
通过详细描述单抗配制过程中需要注意和遵循的各个方面，我们的目标是帮助他们更好地理解并正确执行单抗配制工作，提高临床操作的准确性和安全性。
以上为“1. 引言”部分内容。
2. 单抗配制过程护士要注意事项:2.1 确认患者信息和医嘱:在开始单抗配制之前，护士必须仔细核对患者的个人信息，包括姓名、年龄、性别等，并与医嘱进行一致性确认。
确保所使用的单抗是给予正确的患者，并且符合医生指示。
2.2 准备工作环境和材料:在开始单抗配制之前，护士需要确保工作环境整洁无菌。
清理工作台面并使用消毒剂对其进行消毒。
同时，检查所有所需材料是否齐全并处于有效期内，包括注射器、针头、试剂、溶剂等。
2.3 配置单抗的步骤与规范操作:以下是配置单抗的步骤和规范操作：1) 准备好所有需要用到的药物及溶液。
2) 戴上手套和口罩以确保个人卫生，并避免污染药品。
3) 按照医嘱中规定的剂量准确称量所需药物。
4) 将溶剂转移到药品瓶中，并轻轻摇动使其充分溶解。
5) 将药品抽取并注入空白的注射器中。
6) 顺利进行专用贴纸（标签）的填写以确保能够识别瓶上的药物信息。
7) 在专门的装满可回收容器中丢弃废弃物和使用过的药品容器。
请注意，以上步骤只是一个基本的示例，并且应根据实际情况和医生指示进行调整。
贝伐单抗注射液批生产工艺设计与验证
贝伐单抗注射液批生产工艺设计与验证贝伐单抗（Bevacizumab）注射液是一种抗肿瘤药物，广泛应用于多种癌症的治疗。
本文将根据提供的任务名称，详细介绍贝伐单抗注射液的批生产工艺设计与验证。
一、贝伐单抗注射液的成分和性质贝伐单抗注射液主要成分为贝伐单抗（Bevacizumab），它是一种嵌合的人源单克隆抗体。
贝伐单抗结构稳定，药理作用和安全性良好。
通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）的活性，贝伐单抗能够抑制肿瘤血管生长，从而达到抗肿瘤的治疗效果。
二、贝伐单抗注射液的批生产工艺设计1. 前处理与准备贝伐单抗的原料需要经过悬浮培养、纯化和过滤等步骤进行前处理。
培养过程中，需要合理调节培养基的组成和条件，确保贝伐单抗的表达和纯化效果。
纯化过程中常采用蛋白A亲和层析技术，以去除其他杂质。
2. 形成复合物贝伐单抗通过与VEGF结合来发挥治疗作用，因此在生产过程中需要与VEGF 进行复合反应。
复合反应的条件需控制在适宜的pH值和温度下进行，以保证复合物的稳定性。
3. 灭菌处理贝伐单抗注射液作为一种无菌制剂，需进行灭菌处理。
灭菌方法通常采用高温高压灭菌法，如蒸汽灭菌或高压灭菌。
灭菌过程需考虑到产品的稳定性和设备的操作性。
4. 填充与包装灭菌处理后的贝伐单抗注射液，需要进行填充与包装。
填充过程中需要遵循无菌原则，采取适当的容器和包装材料，并确保严密密封，以保持药物的质量和稳定性。
三、贝伐单抗注射液批生产工艺的验证1. 工艺验证工艺验证是为了确认工艺过程能够稳定可靠地生产出符合质量标准的产品。
验证过程中，应验证关键工艺参数的可接受范围，如培养条件、纯化效率、复合反应的条件等。
同时需要对工艺中的关键步骤进行确认，确保产品的稳定性和一致性。
2. 清洁验证贝伐单抗注射液的生产设备需要进行清洁验证，以确保设备在不同批次间的清洁程度。
清洁验证应采用适当的方法和指标，如残留物检测和微生物检测等。
3. 稳定性验证贝伐单抗注射液的稳定性验证是为了确认产品在储存和运输过程中的稳定性。
单抗制备技术近十年来进展
说了这么多，还是很沮丧，虽然看起来选择很多，但是能真正用到工作中的选择并不多，有时候是条件问题，有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。
动物免疫
动物免疫故事比较多，简单点说。
实验动物的选择： 做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论，epitomics对其有特殊的专利，这个基本上和咱们没关系。小鼠，用得最多的还是Balb/C了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0, X63, Ag8.653,FO和NSO）都来自于Balb/C小鼠，为了使hybridomas稳定，所以实验小鼠基本上还是Balb/C。 不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的，原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型，一般在5个月以下时基本不会发病，但是对自身的蛋白仍然有潜在的排斥反应。
另外还有体外免疫的，即把脾脏从正常小鼠体内取出无菌培养，直接向培养基中添加抗原。 这种方法成功例子也非常多，毛病在于很难得到高亲和力的抗体，几乎所有的抗体都是IgM亚型的，不过也有少数人踩狗屎运得到其它亚型的情况。这种免疫方式可能更多地用于很难免疫成功的抗原，特别是小鼠自身抗原的单抗的制备，比如说要制备抗小鼠白蛋白的单抗神马的，可以看看这篇文章：In vitro immunization effect of growth and differentiation factors on antigen-specific b cell activation and production of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak immunogen。只当是一种备用方案了。
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望生物制剂在临床治疗和商业上的成功，推动了全球对生物产能的巨大需求。
生物制剂上游产能已经得到显著提升，但同时也给下游去杂和纯化过程造成障碍，开发高通量去杂和纯化技术成为新的瓶颈。
细胞培养环境的多样性使得制品中的杂质复杂多样，痕量的杂质残留都会在人体产生严重的免疫反应，因此必须使制品所含杂质的成分和浓度控制在制品的质量要求之下。
制品中的杂质主要由两部分组成，一种与制品本身相关，另一种由生产过程中带入。
与制品相关的杂质包含制品组分的多聚体、降解产物、错误翻译产物等；生产过程中带入的杂质包括残留的细胞组分、添加剂、培养基等。
其中宿主细胞蛋白质（HCPs）和核酸（DNA）是最主要的杂质。
杂质去除始于制品纯化的初始阶段，以减轻下游纯化的负担，也有利于保护下游纯化设备、提高纯化效率。
所使用去杂技术的的适用性、去杂效率、运行成本等都需要纳入考虑范畴。
本文主要介绍三种去杂技术：沉淀、絮凝和深层过滤。
沉淀技术沉淀技术长期用于血浆蛋白纯化、抗体分离和富集，通过降低目标组分的溶解度实现。
沉淀极大浓缩产物，实现溶剂置换。
改变培养液pH、电导率和加入沉淀剂等可选择性地改变沉淀对象。
改变细胞培养液pH，尤以使培养液pH低于杂质等电点，可有效地去除HCPs和DNA。
沉淀剂是一类低溶解度物质。
沉淀剂破坏胶体的平衡状态，触发沉淀。
降低培养液pH与沉淀剂共同作用，低pH条件进一步降低沉淀剂的溶解度从而引起共沉淀。
辛酸及其钠盐用于沉淀血浆、血清和腹水蛋白质。
酸性条件下，酸性蛋白质（如HCPs）被沉淀，偏碱性的抗体保持溶解状态。
有研究发现，辛酸对抗体的纯化效果优于抗体片段（FC片段），可能由于抗体的疏水基团包裹于内。
辛酸破坏包膜病毒的脂质层，使病毒失活，但对非包膜病毒效果不明显。
有机溶剂通过分步沉淀达到纯化混合蛋白质的目的。
但高浓度的有机溶剂引起蛋白质变性，其疏水基作用产生的高温同样使蛋白质变性。
单抗制备-细胞融合筛选过程中遇到的问题及对策
单抗制备-细胞融合筛选过程中遇到的问题及对策
1,融合率低，阳性孔少
①免疫的问题。
由于免疫原性不强或者免疫途径不当造成免疫弱，效价低。
②融合过程中温度、时间、PEG分子量，作用时间等。
③脾细胞是否取出了足够多的细胞，有无组织碎片干扰。
④融合前骨髓瘤细胞生长状态是否完好，细胞是否浑圆，透亮，成对数生长。
2，单抗亲和力整体低
①免疫的问题。
免疫途径不当或者免疫原问题。
②融合细胞筛选过程出现遗漏，筛选方法不当或检测方法不当，造成没有筛到高亲和力的融合细胞。
③由于亚克隆细胞生长环境不合适，导致融合细胞染色体丢失，分泌特性改变，亲和力从高变低，这时就需要及时更换培养液，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失；控制好细胞的密度，密度过大使新加入的培养基不至于很快被消耗，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失；不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。
操作细致，防止细胞被支原体等微生物污染。
3,抗体亲和力从高变低
①没有及时更换培养液，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失或者性状改变。
②控制好细胞的密度，密度过大使新加入的培养基不至于很快被消耗，影响融合细胞的生长，造成染色体丢失或者性状改变。
③过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。
④细胞被支原体等微生物污染。
⑤亚克隆次数超过5次，导致细胞生长环境经常被改变，弱的阳性杂交瘤细胞染色体丢失或者性状改变。
单克隆抗体制备常见问题分析
单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。
我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。
鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。
二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
关于_单克隆抗体_中相关问题的探讨_陈颜
是人淋巴细胞中有这两种 DNA 的合成途径， 但一般 不分裂增殖。 而鼠骨髓瘤细胞中虽然没有 S 途径，但 能不断分裂增殖。
因此，在 HAT 培养液中，未融合的效应 B 细胞和 B 淋 巴 细 胞 —B 淋 巴 细 胞 融 合 细 胞 的“ D 途 径 ”被 氨 基喋呤阻断，虽“ S 途径”正常，但因缺乏在体 外 培 养 液中增殖的能力，一般 10 d 左右会死亡。 而骨髓瘤细 胞 自 身 没 有“ S 途 径 ”， 且“ D 途 径 ” 又 被 氨 基 喋 呤 阻 断，所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。 唯 有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互融合形成的杂交瘤 细胞，在 HAT 选择性培养基上，既具有效应 B 细胞的 “ S 途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增 殖的特性，因此能在 HAT 培养液中选择性存活下来， 并不断增殖，这就是所需的杂交瘤细胞。
液中， 放置了多个骨髓瘤细胞与多个多种 B 淋巴细 胞，由于动物细胞融合是一个随机的过程，所以经融 合后细胞将以多种形式出现。如果只考虑两两融合的 情况， 会有融合的骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞、B 淋巴 细胞—B 淋巴细胞、B 淋巴细胞—骨髓瘤细胞以及未 融合成功的单个骨髓瘤细胞、单个的 B 淋巴细胞。 那 么如何从众多的细胞中筛选出杂交瘤细胞呢？
现就学习过程中，学生难以理解的知识点加以分 析总结，以帮助学生正确理解相关知识。 1 传统制备抗体的缺点及理解
长期以来，人们为了获得抗体，传统的方法是向 动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后 从动物的血清中分离所需的抗体。 这种方法不仅产 量低，纯度低，而且制备的抗体特异性差。 采用传统 方法制备的抗体为什么产量低，纯度低，而且特异性 差？
从众多类型的细胞中筛选出杂交瘤细胞，普遍采 用的 HAT 选择性培养基， 也就是在普通的动物细胞 培养液中加入次黄嘌呤（ H） 、氨基喋呤（ A） 和胸腺 嘧 啶核苷酸（ T） 。 已知细胞中的 DNA 合成有两条途径。 ① 生物合成途径（“ D 途径”） ，即由氨基酸及其他小 分子化合物合成核苷酸， 为 DNA 分子的合成提供原 料。 ② 应急途径或补救途径（“ S 途径”） ，是利用次黄 嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（ HGPRT） 和胸腺嘧啶 核苷激酶（ TK） 催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相 应的核苷酸，然后再合成 DNA，两种酶缺一不可。
曲妥珠单抗二三事
曲妥珠单抗二三事2021年1月初，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布了2020年全球最新癌症负担数据。
统计显示，2020年，女性乳腺癌首次超过肺癌，成为全球最常见癌症，严重危害女性的生命健康。
曲妥珠单抗目前已经成为治疗HER-2阳性乳腺癌的重要药物。
今天六院药师现将使用曲妥珠单抗中常见的几个问题为大家总结一下。
HER-2阳性的检测标准如何判断？确定患者是否是HER2阳性乳腺癌可以通过临床检查，首先乳腺癌患者需要取病理标本，进行免疫组化检测（IHC检测）。
如果检测结果为“+++”，即确定该乳腺癌患者HER2阳性，适合靶向治疗。
如果免疫组化检测显示“+”或“++”，则需要荧光原位杂交检测（FISH检测）进一步确诊。
曲妥珠单抗如何发挥其抗肿瘤的机制？曲妥珠单抗是人源化的抗HER-2的单克隆抗体，可以与癌细胞表面的HER2受体结合，起到靶向治疗的作用。
此外，曲妥珠单抗能够介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC），在HER-2阳性的肿瘤细胞中比HER-2阴性的肿瘤细胞中优先产生。
曲妥珠单抗的适应症有哪些？HER2阳性的早期或转移性乳腺癌的新辅助或辅助治疗，还可以用于治疗HER2阳性的转移性胃癌。
曲妥珠单抗的毒副反应主要有哪些？曲妥珠单抗治疗乳腺癌最常见的不良反应有：发热、恶心、呕吐、输注反应、腹泻、感染、咳嗽加重、头痛、乏力、呼吸困难、皮疹、中性粒细胞减少症（联合化疗时发生率高于单纯化疗）、贫血、肌痛。
需要特别注意的是，曲妥珠单抗可引起明显的心脏毒性，包括左心功能不全，心律失常，心衰，心肌病，心源性死亡等，尤应警惕。
曲妥珠单抗还可引起肺毒性包括间质性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺炎、非感染性肺炎、胸腔积液、急性肺水肿等，严重时可导致死亡。
如果出现以下严重不良反应，如：充血性心力衰竭、左室射血分数明显下降、严重的输注反应和肺毒性，需要中断或停止使用曲妥珠单抗。
此外，大约40%的患者在初次使用曲妥珠单抗时出现输注反应，最长见的是寒战和发热，可以使用对乙酰氨基酚、苯海拉明等对症处理。
单抗中常见问题解析
1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？答：可以从这几个方面一一考虑：（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。
对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。
（2）免疫的周期不正确。
免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。
（3）免疫佐剂不合适。
TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。
（4）免疫剂量不合理。
过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。
一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。
（5）免疫途径不合理。
对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。
（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。
同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。
对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。
2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？答：可以从这几个方面考虑：（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。
免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。
（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。
（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。
单抗的制备、纯化和鉴定
单抗的制备、纯化和鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
抗体药物工艺相关杂质分析
抗体药物工艺相关杂质分析抗体药物是一类通过人工合成的抗体来治疗疾病的药物，其通过与目标分子特异性结合从而达到治疗的目的。
常见的抗体药物类型包括单克隆抗体、人工合成的抗体片段、免疫毒素、抗体药物共轭物等。
抗体药物在治疗多种疾病方面表现出显著的疗效，如癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、免疫调节及眼科疾病等。
但在抗体药物的生产过程中，可能会引入一些与生产工艺相关的杂质。
宿主细胞蛋白（HCP）是在生物制药（如单克隆抗体）工艺过程中所产生的杂质，其超过一定含量则很有可能会引起免疫反应或其他不良反应。
宿主细胞的HCP中也包含一些蛋白水解活性酶，可使目的蛋白发生片段化，从而导致总产品降低。
除了会导致目的蛋白降解和片段化以外，HCP还会导致蛋白聚集等种种不良影响。
因此，HCP残留量检测是抗体药物产品研发与质控中最常进行的分析项目，HCP残留数值越低，则产品质控越好。
宿主细胞DNA（HCD）残留存在一定的致癌性和风险性，甚至有引发肿瘤的潜在风险。
因而，宿主细胞残留DNA的检测对监测抗体药物的安全性和质量可控性也至关重要。
除此之外，还有proteinA、消泡剂等杂质也需要注意。
目前，HCP检测常用的方法为酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法可以采用多克隆抗体直接量化分析HCP的总体丰度。
然而，一般无法采用此法快速定量分析单个HCP组分，且可能检测不到免疫原性较弱或非免疫原性的HCP。
当前已开发出多种互补的分析用于监测HCP，包括1D/2D-PAGE、基于质谱（MS）的分析技术等。
其中，液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）可同时鉴定和定量分析HCP杂质，是ELISA的主要互补分析方法。
《中国药典2020》列出了3种外源性DNA残留检测方法：DNA探针杂交法、荧光染色法以及定量PCR法。
相比于DNA探针杂交法和荧光染色法两种方法，定量PCR法具有更高的灵敏度，精确性以及重复性。
生物制品表征工艺相关杂质分析示意图。