实验九质粒DNA的制备和酶切
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
酶切检测实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握限制性核酸内切酶（RE）的原理及其在分子生物学中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习并实践质粒DNA的酶切技术。
4. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用。
5. 分析酶切结果，鉴定目的基因。
二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列处切割双链DNA的酶。
它们在分子生物学中具有广泛的应用，如基因克隆、基因编辑、基因表达调控等。
质粒DNA是常用的克隆载体，其提取方法主要有碱裂解法、盐析法等。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
酶切是将质粒DNA切割成大小不同的片段，通过琼脂糖凝胶电泳技术分离这些片段，从而鉴定目的基因。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，其原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率差异进行分离。
在电场作用下，DNA分子带负电荷，会向正极移动。
DNA分子的大小与其迁移速率成反比，因此，通过比较不同片段的迁移距离，可以鉴定DNA片段的大小。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（RE）3. 琼脂糖凝胶4. TAE缓冲液5. DNA marker6. 电泳仪7. 显色剂8. 紫外灯四、实验步骤1. 质粒DNA提取- 将含有质粒DNA的菌液接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
- 取适量菌液，加入等体积的碱裂解液，混匀，室温放置5分钟。
- 加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入700 μL 70%乙醇，混匀，室温放置5分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入50 μL无菌水，混匀，即得质粒DNA。
2. 酶切- 取10 μL质粒DNA，加入10 μL限制性核酸内切酶缓冲液，混匀。
- 加入1 μL限制性核酸内切酶，混匀。
- 37℃水浴反应3小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳- 配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA marker。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒提取及酶切实验的注意事项
质粒提取及酶切实验的注意事项一、前言质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。
在执行实验时，需要遵守一些注意事项，以确保实验能够成功并得出可靠的结果。
本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项1.使用高质量的DNA提取试剂：DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和纯度有很大的影响，因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术：细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质量至关重要，因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度：在质粒提取过程中，需要注意DNA的浓度，因为浓度过低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议：在进行质粒提取实验时，必须严格遵守标准协议，包括使用正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰：在提取质粒的过程中，可能会出现杂质，如蛋白质或RNA。
这些杂质可能会干扰后续实验的结果，因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项1.使用高质量的酶：选择适当的酶是酶切实验成功的关键。
不同的酶适用于不同的DNA序列，因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间：酶切实验中，酶的浓度和反应时间都对结果有很大的影响，因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议：遵循酶切实验的标准协议非常重要，包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件：酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。
必须确保缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验：在酶切反应中，应该与相应的对照样品一起进行，以确保实验的准确性和精确性。
四、总结在分子生物学中进行质粒提取和酶切实验是很常见的实验技术，这些实验的成功非常重要，因为它们是分子生物学实验的基础。
在进行实验前，必须了解每个步骤的重要性和所需的操作技能。
在实验的过程中必须严格按照规定的方法和协议进行。
通过遵守上述注意事项和规程，可以获得高质量的实验结果。
实验九 DNA的酶切
实验九 DNA的酶切一、原理1．三类限制酶限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。
限制酶可分为3类。
I类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。
Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。
而I类限制酶结合在识别序列上，但却随机地切割回转到被结合酶处DNA。
在基因工程中I类和Ⅲ类限制酶都不常用。
常用的是I类限制酶。
2．Ⅱ类限制酶Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割裂一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。
基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种I类限制酶。
3．限制性内切酶(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoR I识别序列为：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。
(2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。
(3)切割方式两种A．错位切割大多数限制性内切酶不在识别序列的对称轴上切割DNA链，而在偏离对称轴数个核甘酸处切割。
错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为粘性末端(Cohesive Ends)。
带有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。
B.沿对称轴切割，一些酶在对称轴处切割，产生平齐末端(Blunt Ends)。
(4)同裂酶(同切口限制性内切酶)一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。
然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。
这些酶称为同裂酶(Ischizomers)。
有—些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau3A I，识别序列在BamHl之内。
两种酶切割反应要求最严的成分是底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。
提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反心，有些甚至改变识别序列两种酶切割后得到相同末端．所以这两种酶产生的片段可以连接。
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
质粒酶切实验报告讨论
一、实验背景质粒是细菌染色体外的DNA分子，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中。
质粒DNA在分子生物学研究中具有重要意义，如基因克隆、基因表达、基因编辑等。
质粒酶切实验是分子生物学实验中的一项基础技术，通过限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒DNA，得到特定的DNA片段，从而实现基因克隆、基因表达等目的。
本实验旨在通过质粒酶切实验，对提取的质粒DNA进行酶切，并利用琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切结果，以验证实验的准确性。
二、实验方法1. 质粒DNA提取（1）采用碱裂解法提取质粒DNA，具体操作如下：① 将含有质粒的细菌培养至对数生长期，收集菌液。
② 向菌液中加入溶菌酶，37℃水浴30分钟，使细胞壁破裂。
③ 加入等体积的碱液（NaOH），混匀，室温放置5分钟。
④ 加入等体积的冰乙酸，混匀，室温放置5分钟。
⑤ 12,000 r/min离心5分钟，取上清液。
⑥ 加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
⑦ 12,000 r/min离心10分钟，弃上清液。
⑧ 加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 r/min离心5分钟。
⑨ 弃上清液，将沉淀溶于50μl TE缓冲液中。
（2）检测质粒DNA浓度和纯度，具体操作如下：① 使用紫外分光光度计测定质粒DNA在260nm和280nm处的吸光度值。
② 根据公式计算质粒DNA浓度和纯度。
2. 质粒DNA酶切（1）选择合适的限制酶，根据质粒DNA序列设计酶切位点。
（2）配制酶切反应体系，包括质粒DNA、限制酶、缓冲液等。
（3）将反应体系置于37℃水浴中酶切反应4小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的溴化乙锭（EB）。
（2）将酶切后的质粒DNA样品和DNA分子量标准样品加入琼脂糖凝胶孔中。
（3）100V电压电泳1小时。
（4）紫外灯下观察并拍照记录电泳结果。
三、实验结果与分析1. 质粒DNA提取结果通过紫外分光光度计检测，质粒DNA浓度为100ng/μl，纯度为1.8（A260/A280），符合实验要求。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.质粒DNA的制备：首先需要从大肠杆菌等细菌中提取质粒DNA。
通常方法是通过破碎细菌细胞并利用离心等步骤纯化质粒DNA。
也可以通过体外扩增技术如PCR获得所需的DNA片段。
2.DNA片段的制备：如果需要连接多个DNA片段，就需要对不同的DNA片段进行提取和纯化。
可以利用限制酶切、PCR等技术将所需的片段放入载体中。
3.线性化载体的制备：选取合适的载体，通常是质粒或噬菌体。
首先需要线性化载体，以便容纳连接的DNA片段。
这可以通过限制酶切除去所需连接部分的DNA序列来实现。
4.生成粘性末端：对于需要连接的DNA片段和线性化载体，需要使其末端具有互补碱基序列，以便后续的连接。
这可以通过在连接反应中引入适当的酶来完成，例如聚合酶、牛碱性磷酸酶等。
5.DNA连接反应的进行：将线性化载体与DNA片段放在连接反应的体系中，同时加入DNA连接酶和连接缓冲液。
酶的作用是催化连接反应，连接缓冲液提供了适合的pH和离子环境。
6.酶切修复：DNA连接反应后，需要将未连接的DNA片段去除，并对连接的DNA进行修复。
这可以通过加入限制酶来切除未连接的DNA，再加入DNA连接酶和连接缓冲液来进行修复。
7.质粒复制和筛选：完成酶切修复后，将连接后的DNA转化到宿主细胞中，使其进行质粒复制。
然后利用抗生素筛选或其他遗传标记来筛选出含有目标连接片段的质粒。
DNA连接反应是一个基本而重要的实验技术。
其步骤主要包括质粒DNA的制备、DNA片段的制备和线性化载体的制备、生成粘性末端、DNA 连接反应、酶切修复以及质粒复制和筛选。
在这个过程中，酶的作用起到了催化和修复的关键作用，而连接缓冲液则提供了适合的环境。
通过这一系列的步骤，可以将不同的DNA片段成功连接起来，实现对目标序列的操纵和重组。
这个技术在基因克隆、DNA工程和生物学研究中被广泛应用，为科学家提供了强大的实验工具。
酶切分析实验报告
一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。
在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。
本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。
通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。
2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。
- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。
- 连接电源，进行电泳。
- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。
4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。
- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。
- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。
五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。
2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。
- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。
质粒的提取与酶切实验报告
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法，用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究，比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化，然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物，最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列，将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶，常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时，应注意实验条件的控制，包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外，应注意保护样品的纯度，避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时，还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性，以防止不必要的酶切。
在实验报告中，应详细记录实验条件和步骤，并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验，应记录使用的提取方法、提取效率和纯度，并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验，应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率，并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说，质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验，在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度，并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
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质粒特点
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.
１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒
1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功
能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长 的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制 依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染 色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的 拷贝数可达2000-3000拷贝。
2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加。
实验试剂
ＬＢ培养基：
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g 定容
1000ml pH
7.5NaCl1Fra bibliotekgＳＴＥ：
0.1M
NaCl
10mM
Tris HCl(pH8.0)
1mM
EDTA
ＡｍＰ 50mg/ml
溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）
试剂
溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容 物，冰上放置5分钟。
５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的
Eppendorf管中。
５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分 钟。
６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的 Eppendorf管中。
溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA
Enzymes which cut pBluescript II KS(+) DNA once: Acc65I 755, AdeI 222, AflIII 1153, AloI 169, ApaI 749, BamHI 689, BcgI 2562, BcuI 683, BsaAI 225, Bsp120I 749, BstXI 658, Bsu15I 725, BtgI 661, CaiI 1564, Cfr9I 695, Cfr42I 661, Eam1105I 2041, Ecl136II 653, Eco31I 2113, Eco32I 713, Eco52I 670, EcoO109I 748, EcoRI 707, FaqI 457, GsuI 2131, Hin1I 2582, HincII 734, HindIII 719, KpnI 755, NotI 669, OliI 659, PdiI 328, PdmI 2641, PscI 1153, PsiI 97, PstI 701, SacI 653, SalI 734, SapI 1030, ScaI 2524, SmaI 695, TatI 2524, XbaI 677, XceI 1153, XhoI 740, XmiI 734.
(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。)
８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。
９． １２０００g ,4 ℃离心５分钟。
１０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠 倒数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。
１１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。
１２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶 解DNA,然后交给助教加RNA 酶，之后37℃10分钟。
１２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA,
然后交给助教加RNA 酶，之后 13．取2μl DNA溶37解℃液用1Ｔ0Ｅ分稀钟释至。200ul测定OD260
质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒
害致死的基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
本实验目的
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、
三．实验方法
１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过夜。
２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒， 弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一 次，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰 上放置5分钟。
碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
实验十五 碱变性法小量制备质粒 DNA和DNA酶切
1、质粒DNA的提取
一．实验目的及背景
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。
大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。
其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。