血浆脂蛋白琼脂糖电泳课件
实验七 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
实验七血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。
2、熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。
3、掌握正常人血浆脂蛋白的分类。
二、实验原理琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。
电泳时，因为凝胶中含水量大（98%-99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。
而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。
血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在，各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。
因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。
将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红）进行预染。
再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离，通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。
此法应用于高脂蛋白血症的分型。
三、器材和试剂1、器材：电泳仪、电泳槽、离心机、水浴锅、染色盘、微量注射器、滤纸、镊子剪刀、2cm*8cm玻璃片2、试剂⑴巴比妥缓冲液（PH8.6）：称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml（PH为8.6，离子强度0.075），作为电极缓冲液。
⑵苏丹黑染色液：将苏丹黑0.5g溶于无水乙醇5ml中至饱和。
⑶凝胶缓冲液：称取三羟甲基甲烷（Tris）1.212g，EDTA0.29g及Nacl5.85g,用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml。
调PH至8.6.⑷琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50g溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。
⑸新鲜血清（无溶血现象）四、操作步骤1、预染血清血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml与试管中，在混合后置于37℃水浴染色30分，然后离心（2000r/min）约5分。
实验三琼脂糖凝胶电泳ppt课件
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
实验七 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
实验七血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。
2、熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。
3、掌握正常人血浆脂蛋白的分类。
二、实验原理琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。
电泳时，因为凝胶中含水量大（98%-99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。
而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。
血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在，各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。
因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。
将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红）进行预染。
再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离，通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。
此法应用于高脂蛋白血症的分型。
三、器材和试剂1、器材：电泳仪、电泳槽、离心机、水浴锅、染色盘、微量注射器、滤纸、镊子剪刀、2cm*8cm玻璃片2、试剂⑴巴比妥缓冲液（PH8.6）：称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml（PH为8.6，离子强度0.075），作为电极缓冲液。
⑵苏丹黑染色液：将苏丹黑0.5g溶于无水乙醇5ml中至饱和。
⑶凝胶缓冲液：称取三羟甲基甲烷（Tris）1.212g，EDTA0.29g及Nacl5.85g,用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml。
调PH至8.6.⑷琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50g溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。
⑸新鲜血清（无溶血现象）四、操作步骤1、预染血清血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml与试管中，在混合后置于37℃水浴染色30分，然后离心（2000r/min）约5分。
琼脂糖凝胶电泳 ppt课件
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
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ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
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注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
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ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
琼脂糖凝胶电泳试验课件
PAG
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0
不同（空间） 不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间 进行缓冲液循环，并经常更新TAE。
缓冲液的离子强度 离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般 离子强度 在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导 电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。 缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样 值 品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带 负电荷，向正极泳动。 在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环 DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温 度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。
2）凝胶孔径大小 ）
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电 泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的 分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。
凝胶
琼脂糖
胶浓度（ ） 线状DNA分子的有效分 胶浓度（%） 线状 分子的有效分 离范围
三、实验原理
概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向
正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳 时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射 下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右 的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约 200bp~50kb。
琼脂糖凝胶电泳24页PPT
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
琼脂糖凝胶电泳 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
血浆脂蛋白琼脂糖电泳课件PPT课件
血浆脂蛋白琼脂糖电泳课件
【原理】
琼脂糖（agarose）
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半 乳糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作
用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型
凝胶。
2
3
【原理】
血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以 琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比 妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、 大小、形状分离成不同区带。
颗 粒
密 度
7
（三）结 构 特 征
CM
甘油三脂
多
胆固醇
多
H8.6为例
颗粒大小（mm） 大
密度
低
电泳速度
慢
形态
VLDL LDL HDL (前β) (β） （α）
少 少 多 多
规则 不规则
小 高 快
8
• pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由 负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态 不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
CM
LDL VLDL HDL
—
+
加样槽
β
前β α
9
【试剂与器材】
• 1.人血清（预染） • 2.微量加样器 • 3.电泳仪、电泳槽 • 4.琼脂糖 • 5.巴比妥缓冲液（pH8.6）
10
【操作】
血清预染
制胶
适量琼
适量缓
Δ
脂糖
冲液
琼脂糖 胶溶液
11
1
2
40mL
去封口
+
胶布
–
3
4
点样孔 朝负极
12
4
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成
琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤凝胶电泳加样 ppt课件
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤凝胶电泳加样
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加 入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝 条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤凝胶电泳加样
⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。
5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态， 但EB会导致线形DNA迁移率下降，这在酶切质粒与空白 对照质粒一起电泳时应值得注意。
6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向 相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙 锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处 理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分 钟。
6×凝胶载样缓冲液
类型 I II
III IV
6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 40% (m/V)蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 15% 聚蔗糖(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40% (m/V)蔗糖水溶液
琼脂糖类型
标准琼脂糖
高强度琼脂糖 修饰的低熔点/ 凝 点琼脂糖 超低熔点
低黏性低熔点琼脂 糖
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【目的】
➢ 掌握脂蛋白的分类及其代谢特点。 ➢ 掌握脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳检测的原理，熟
悉其方法 。
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【原理】
血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以 琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比 妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、 大小、形状分离成不同区带。
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血清脂蛋白(lipoprotein)的组成
易外溢。 (5) 样品点于电泳槽负极。 (6) 吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有
染料颗粒沉渣。
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临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β
正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型
α
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思考题
1. 影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。
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血清预染
制胶 倒上缓冲 液，使其 恰好没过 点样孔。
点样
3
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血清预染
制胶 倒上缓冲 液，使其 恰好没过 点样孔。
点样
3
预染色的标本 （15μL）
小心！！！ 点样孔不要
戳破
14
血清预染 制胶
点样
电泳
80－100V， 20－30min,
负极向正极
15
16
操作注意事项：
(1) 制胶时，要注意梳子的低部要距制胶板1mm以上。 (2) 凝胶冷却时要水平放置，完全凝固后才能使用。 (3) 点样时要小心，不要戳穿点样孔。 (4) 点加样品时，要缓缓加入，不能太快，否则样品容
5
分类 1. 按电泳法分
按其移动的快慢，可将脂蛋白依次分为：α-脂 蛋白、 前β-脂蛋白、β-脂蛋白，乳糜微粒在原点 不动。
乳糜微粒 β 前β α
+
血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳图谱
6
2. 按超速离心法分 乳糜微粒(CM) 极低密度脂蛋白 (VLDL) 低密度脂蛋白(LDL) 高密度脂蛋白(HDL)
颗 粒
CM
LDL VLDL HDL
—
+
加样槽
β
前β α
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【试剂与器材】
• 1.人血清（预染） • 2.微量加样器 • 3.电泳仪、电泳槽 • 4.琼脂糖 • 5.巴比妥缓冲液（pH8.6）
10
【操作】
血清预染
制胶
适量琼
适量缓
Δ
脂糖
冲液
琼脂糖 胶溶液
11
1
2
40mL
去封口
+
胶布
–
3
4
点样孔 朝负极
12
密 度
7
（三）结 构 特 征
CM
甘油三脂
多
胆固醇
多
蛋白质
少
带电量（Q）
少
pH8.6为例
颗粒大小（mm） 大
密度
低
电泳速度
慢
形态
VLDL LDL HDL (前β) (β） （α）
少 少 多 多
规则 不规则
小 高 快
8
• pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由 负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态 不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。