Miseq上机操作指南

Miseq建库定量上机

2016-7-25

一、文库的定量、标准化和混合

基于Qubit定量结果进行换算

如：5ng/ul的Nana或Qubit定量结果，预估建库长度为500bp则，换算浓度为5/（660*500）*106 = 15.3nM

根据计算结果，用10mM的Tris-HCl（pH 8.5）把文库稀释到终浓度为4nM。

二、文库稀释

测序前，混合文库会以NaOH进行变性，再用杂交buffer进稀释，当MiSeq 测序前，再进行热变性。对于低多态性的文库来说，每一个run中需要加入至5%的PhiX用作测序质控。

准备工作：

1、800ul的水和200ul1N的NaOH。颠倒数次混匀。

2、把Miseq的试剂盒从冻存冰箱里取出，在室温下解冻。

3、准备一个冻桶，其中冰和水的比例为3：1。

DNA变性：

1、将最终的文库和新配的NaOH混合：5ul的4nM混合文库，5ul的0.2N 的NaOH

2、在12小时以内，0.2N的NaOH与PhiX质控相混合，并保存。

3、旋涡振荡后，短暂离心。

4、室温静置5min，等DNA变性。

5、向文库中加入预冷的HT1（杂交液）：10ul的变性DNA，990ul的预冷HT1

结果是在1mM的NaOH中为20pM浓度的变性DNA文库，文库总量为0.02pmol。

6、所得稀释液置于冰上。

稀释变性DNA

1、变性DNA文库稀释到上机的终浓度。

当使用MiSeq v3时，原始簇（raw cluster）的密度是800-1000K/mm2。

当第一次上机时，建议使用4pM的上机浓度，但可以随之调整。目前采

用8pM。

2、短暂离心后，把反应体系置于冰上。

三、文库上机

1、取出测序试剂盒，放置于常温水中（注意不要漠过上线）。静置60~90分钟，直至完全溶解。

2、从水浴中取出试剂盒，上下颠倒十次混匀。擦干表面的水分。

3、创建Sample Sheet。注：特别注意设置barcode

4、开机，运行pre-Wash。约1小时。

3、点击“Sequence”，按页面指示进行。