微生物学实习报告

待测样品中微生物的分离、培养和鉴定及菌落特征观察

一、实习目的

1、掌握待测样品中各种微生物的分离成纯种；

2、掌握真菌、细菌的菌落特征，细菌革兰氏染色法、真菌水玻片的制作方法。

二、实习原理

微生物具有个体微小的特征，对于微生物可以说是无处不在，同时微生物也是物种最丰富的生物类群。微生物广泛存在土壤、空气和各种自然状态的水中。我们可以从土壤、空气、水中分离得到各种各样的微生物，如细菌、真菌和放线菌，在不同的培养基额培养温度就可分离得到。真菌一般具有丰富的菌丝有的气生菌丝发达，有的气生菌丝和营养菌丝发达，真菌菌丝较粗而长，菌落表面干燥，如霉菌。细菌菌落一般呈现出湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、菌落正反面颜色相近。

细菌的细胞壁有肽聚糖构成，有的细菌细胞壁的肽聚糖层多达50多层，用革兰氏染色法染色后菌体细胞呈现紫色，另外一些细菌则是仅有几层肽聚糖层，革兰氏染色法染色后菌体呈现红色。革兰氏染色法是细菌中常用的染色方法。其机制是：通过结晶紫初染和碘液媒染后，可在细菌的细胞壁内形成不溶于水的结晶紫碘复合物。革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖厚且交联程度高，在用乙醇脱色时复合物不会流出细胞壁，细胞始终保持紫色，而革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖层薄交联程度低，而且脂类物质含量高，在用乙醇脱色时，脂类物质会被溶解复合物流出，用番红染液染色后菌体细胞呈现出红色。因此用革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两类。

三、实习方法

1、实验材料

采取东二院的植被下的土壤。

2、培养基

马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA培养基）、牛肉膏蛋白胨培养基

3、实验过程

3.1 按照培养基配方配制培养基，配制好的培养基高温高压灭菌30min。

PDA培养基：去皮马铃薯200g，蔗糖或葡糖糖20g、琼脂15—20g，蒸馏水1000ml；

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂15—20g，蒸馏水1000ml，PH7.4。

3.2 土壤处理

将土壤放入洁净的研钵中轻慢磨细，再用细筛子滤去较大的颗粒。称取5g土壤置于45ml无菌水中摇匀静置片刻。将土壤磨细是为了使土壤中的微生物从土壤中尽量完全释放出来。

3.3 平板涂布

在无菌环境下向无菌试管中取9ml无菌水，从稀释好的样品中吸取1ml上清悬浮液放入9ml无菌水中再稀释。此时土样总共稀释了100倍。从试管中取200 ul样液于牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基中。用三角涂布棒涂匀，置于30℃下培养一段时间。

3.4 细菌和真菌形态的观察

细菌形态采用革兰氏染色法对细菌染色，真菌制作水玻片观察其菌丝形态。制作细菌涂片。先在载玻片上滴上一滴无菌水用接种环挑适量的细菌在无菌水上，在酒精灯附近将玻片烤干（玻片不能太热否则烤死细菌），已到达固定的目的。固定好的玻片就可以进行革兰氏染色。先用结晶紫初染1min水洗，卢戈氏碘液媒染1min水洗，酒精脱色，番红复染1min水洗。盖上盖上盖玻片显微镜下观察染色结果。制作真菌水玻片。

同样在载玻片上滴一滴无菌水，用接种环挑适量的真菌菌落在无菌水上，盖上盖玻片并

轻压盖玻片。显微镜下镜检，观察真菌菌丝形态。

四、实习结果及讨论

1、牛肉膏蛋白胨培养基上的细菌菌落和PDA培养基上的真菌菌落；细菌菌落小而湿润，菌落几乎透明；真菌菌落四周有丝状结构。

细菌菌落

牛肉膏蛋白胨培养基上的细菌

真菌菌落

2、革兰氏染色后的细菌形态如下图

杆状的革兰氏阳性细菌

革兰氏阴性细菌

3、真菌菌丝的观察

4、细菌和真菌菌落真菌菌丝