酶分子的化学修饰
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第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
修饰剂
PEG PEG PEG PEG
抗原性
消 除 消 除 消 除 消 除
腺苷脱氢酶
天然酶与修饰酶的半衰期比较
酶
过氧化氢酶 Arg 酶 Gln-Asn酶 尿酸酶 超氧化物岐化酶 羧肽酶
修饰剂
PEG 右旋糖苷 糖肽 白蛋白 白蛋白 右旋糖苷
半衰期 天然酶 修饰酶
6h 1.4h 1h 4h 6min 3.5h 8h 12h 8h 20h 4h 17h
五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最 适pH发生了变化，这在应用上具有重要 意义。
天然酶与修饰酶的最适pH
酶
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
六、Km 的变化:有些酶经化学修饰后， Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。
（二）酶的小分子修饰作用：主要是利 用一些小分子修饰试剂，通过共价结合 来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、 -SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定 性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖 基和甲基等。
（三）酶的大分子修饰作用：可分为非 共价修饰和共价修饰两大类： 1、大分子非共价修饰：利用一些大分子 试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进 行有效的保护。
（四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过 脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对 酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后 在适当条件下，重新进行折叠。
三、与辅因子相关的修饰 对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修 饰： 如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将 辅因子共价结合于酶分子上； 引入新的具有更强反应的辅因子。
尿酸酶 Gln-Aln 酶 SOD酶
PEG
PEG
消 除
消 除 消 除
白蛋白
白蛋白 白蛋白 Poly-DL-Ala
L-Asn 酶
- 葡萄糖苷酶
消 除
降 低 降 低
核糖核酸酶酶
三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰 酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失 活因子的抵抗力均有不同程度的提高。
天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较
四、金属酶的金属取代 酶分子中的金属离子可以被其他金属离 子取代，可以改变酶的专一性、稳定性 等。
第二节
酶化学修饰的基本要求
一、掌握被修饰酶的性质 1、酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳 定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时 的电化学性质，抑制剂的性质等。
2、酶活性中心的状况：包括酶分子活性 中心的组成，如参与活性中心的氨基酸 残基、辅因子等。酶分子的形状、大小 以及寡聚酶的亚基组成。
在基础酶学研究上 探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定 酶蛋白的结构变化与运动 酶的作用机理与催化反应历程 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上 克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性 在工业上的应用 酶稳定性提高，使生产成本降低 反应条件的改善和酶寿命的延长导致生 产工艺的技术革新和改进。
酶
过氧化氢酶 核糖核酸酶 溶菌酶 胰蛋白酶 - 葡萄糖苷酶 尿激酶
修饰剂
右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 白蛋白
抗蛋白酶
抗胰蛋白酶 抗蛋白酶 抗糜蛋白酶 抗胰蛋白酶
抗抑制剂
抗失活剂
抗SDS
抗大豆抑制剂 抗尿素
——
抗胃蛋白酶 抗胎盘抑制剂
抗SDS
四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰 酶在体内的半衰期得到有效延长。
主要研究内容
第一节 酶分子的化学修饰方法 第二节 酶化学修饰的基本要求 第三节 修饰酶的化学性质
第一节
酶分子的化学修饰方法
一、酶的表面修饰 （一）化学固定化：一般是直接通过酶 表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到 惰性载体上；由于载体的引入，使酶所 处的微环境发生改变，进而改变了酶的 性质，特别是动力学性质发生了改变。
例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固 定于酶分子的表面，同时又有效地与外 部水相连，从而保护酶的活力； 一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 等能通过调节酶的微环境来保护酶活力； 另外一些蛋白质可以通过相互作用，排 除分子表面的水分子，降低介电常数， 使酶的稳定性增加。
2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大 分子，通过共价键连接于酶分子的表面， 形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有 许多有用的性质。
（四）分子间交联：利用一些双功能或 多功能试剂将不同的酶交联在一起形成 杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝 乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性 磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分 代谢途径的模型。
（五）脂质体包埋：一些医药用酶，如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易 进入人体细胞内，而且在体内半衰期短， 产生免疫原性反应； 用脂质体包埋法纪可解决这些问题。 脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球 体，酶分子包埋在其内部，可以通过与 细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。
二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量 在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶 活性必需基团，修饰率高，活力回收要 高。
1、pH与离子强度：pH决定了酶分子中反 应基团的解离状态，酶的解离状态不同， 其反应性能也不同；另一方面，有些修 饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应 可以形成不同的产物。离子强度对修饰 反应也有重要影响。
天然酶和修饰酶的热稳定性比较
酶
酰苷脱氢酶
修饰剂
右旋糖苷
处理条件 (℃/时间)
37/100min
残留酶活(%)
天然酶
70
修饰酶
100
胰蛋白酶
过氧化氢酶 溶菌酶 尿激酶 糜蛋白酶
右旋糖苷
右旋糖苷 右旋糖苷 人血清白蛋白 肝 素
100/30min
50/10min 100/30min 37/48h 37/24h
2、修饰反应的温度与时间：严格控制反 应温度和时间可以减少或消除一些非专 一性的修饰反应。 3、反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与 修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰 程度。
第三节
修饰经过化学修饰的酶，热稳 定性有较大的提高。主要是由于修饰试 剂的多个功能基团与酶分子的多个功能 基团相互交联增加了酶分子构象的稳定 性。
（六）反相胶团微囊化：这是近年来发 展起来的酶在有剂相中进行催化的技术， 反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些 表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时 可自发地形成近似球状的反相胶团，反 相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而 极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳 一定量的水，酶溶解在其中避免变性。
加 H2 O
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
修饰剂
PEG PEG PEG PEG
抗原性
消 除 消 除 消 除 消 除
腺苷脱氢酶
天然酶与修饰酶的半衰期比较
酶
过氧化氢酶 Arg 酶 Gln-Asn酶 尿酸酶 超氧化物岐化酶 羧肽酶
修饰剂
PEG 右旋糖苷 糖肽 白蛋白 白蛋白 右旋糖苷
半衰期 天然酶 修饰酶
6h 1.4h 1h 4h 6min 3.5h 8h 12h 8h 20h 4h 17h
五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最 适pH发生了变化，这在应用上具有重要 意义。
天然酶与修饰酶的最适pH
酶
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
六、Km 的变化:有些酶经化学修饰后， Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。
（二）酶的小分子修饰作用：主要是利 用一些小分子修饰试剂，通过共价结合 来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、 -SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定 性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖 基和甲基等。
（三）酶的大分子修饰作用：可分为非 共价修饰和共价修饰两大类： 1、大分子非共价修饰：利用一些大分子 试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进 行有效的保护。
（四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过 脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对 酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后 在适当条件下，重新进行折叠。
三、与辅因子相关的修饰 对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修 饰： 如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将 辅因子共价结合于酶分子上； 引入新的具有更强反应的辅因子。
尿酸酶 Gln-Aln 酶 SOD酶
PEG
PEG
消 除
消 除 消 除
白蛋白
白蛋白 白蛋白 Poly-DL-Ala
L-Asn 酶
- 葡萄糖苷酶
消 除
降 低 降 低
核糖核酸酶酶
三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰 酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失 活因子的抵抗力均有不同程度的提高。
天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较
四、金属酶的金属取代 酶分子中的金属离子可以被其他金属离 子取代，可以改变酶的专一性、稳定性 等。
第二节
酶化学修饰的基本要求
一、掌握被修饰酶的性质 1、酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳 定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时 的电化学性质，抑制剂的性质等。
2、酶活性中心的状况：包括酶分子活性 中心的组成，如参与活性中心的氨基酸 残基、辅因子等。酶分子的形状、大小 以及寡聚酶的亚基组成。
在基础酶学研究上 探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定 酶蛋白的结构变化与运动 酶的作用机理与催化反应历程 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上 克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性 在工业上的应用 酶稳定性提高，使生产成本降低 反应条件的改善和酶寿命的延长导致生 产工艺的技术革新和改进。
酶
过氧化氢酶 核糖核酸酶 溶菌酶 胰蛋白酶 - 葡萄糖苷酶 尿激酶
修饰剂
右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 白蛋白
抗蛋白酶
抗胰蛋白酶 抗蛋白酶 抗糜蛋白酶 抗胰蛋白酶
抗抑制剂
抗失活剂
抗SDS
抗大豆抑制剂 抗尿素
——
抗胃蛋白酶 抗胎盘抑制剂
抗SDS
四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰 酶在体内的半衰期得到有效延长。
主要研究内容
第一节 酶分子的化学修饰方法 第二节 酶化学修饰的基本要求 第三节 修饰酶的化学性质
第一节
酶分子的化学修饰方法
一、酶的表面修饰 （一）化学固定化：一般是直接通过酶 表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到 惰性载体上；由于载体的引入，使酶所 处的微环境发生改变，进而改变了酶的 性质，特别是动力学性质发生了改变。
例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固 定于酶分子的表面，同时又有效地与外 部水相连，从而保护酶的活力； 一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 等能通过调节酶的微环境来保护酶活力； 另外一些蛋白质可以通过相互作用，排 除分子表面的水分子，降低介电常数， 使酶的稳定性增加。
2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大 分子，通过共价键连接于酶分子的表面， 形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有 许多有用的性质。
（四）分子间交联：利用一些双功能或 多功能试剂将不同的酶交联在一起形成 杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝 乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性 磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分 代谢途径的模型。
（五）脂质体包埋：一些医药用酶，如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易 进入人体细胞内，而且在体内半衰期短， 产生免疫原性反应； 用脂质体包埋法纪可解决这些问题。 脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球 体，酶分子包埋在其内部，可以通过与 细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。
二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量 在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶 活性必需基团，修饰率高，活力回收要 高。
1、pH与离子强度：pH决定了酶分子中反 应基团的解离状态，酶的解离状态不同， 其反应性能也不同；另一方面，有些修 饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应 可以形成不同的产物。离子强度对修饰 反应也有重要影响。
天然酶和修饰酶的热稳定性比较
酶
酰苷脱氢酶
修饰剂
右旋糖苷
处理条件 (℃/时间)
37/100min
残留酶活(%)
天然酶
70
修饰酶
100
胰蛋白酶
过氧化氢酶 溶菌酶 尿激酶 糜蛋白酶
右旋糖苷
右旋糖苷 右旋糖苷 人血清白蛋白 肝 素
100/30min
50/10min 100/30min 37/48h 37/24h
2、修饰反应的温度与时间：严格控制反 应温度和时间可以减少或消除一些非专 一性的修饰反应。 3、反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与 修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰 程度。
第三节
修饰经过化学修饰的酶，热稳 定性有较大的提高。主要是由于修饰试 剂的多个功能基团与酶分子的多个功能 基团相互交联增加了酶分子构象的稳定 性。
（六）反相胶团微囊化：这是近年来发 展起来的酶在有剂相中进行催化的技术， 反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些 表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时 可自发地形成近似球状的反相胶团，反 相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而 极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳 一定量的水，酶溶解在其中避免变性。
加 H2 O