高通量测序技术简介

高通量测序技术在宏基因组学中的应用
➢ 基于 16S rRNA 的微生物群落分析 ➢ 基于宏基因组的功能基因分析 ➢ 基于宏转录组的群落转录调控规律分析 ➢ 单细胞分离及宏基因组研究
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Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
• 3.桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA 片断:在Flow cell内加入未被标记的 dNTP和酶起始固相桥型扩增。所有单 链桥型待测片段被扩增成双链桥片断， 通过变性，释放出互补的单链，锚定 到附近的固相表面。通过不断循环， 将会在Flow cell的固相表面上获得上 百万条成簇分布的双链待测片断。
➢ 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后富集，这些片段仍 然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
Solexa测序法原理
Solexa测序技术其的核心思想感是边合成边测序。即生成新DNA互 补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应崔化底物激发出荧光，要么直接 加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出 荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
➢ 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到 800bp的片段
➢ 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和 5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。接头也将在 后继的纯化，扩增和测序步骤中用到
➢ 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别 结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在 这个小滴里进行独立的扩增，从而实现了所有DNA片段进 行平行扩增（emPCR）。
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
SOLiD测序法简介
SOLiD全称为 supported oligo ligation
detetion，它的独特之处在于以四色荧光标 记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传 统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进 行大规模扩增和高通量并行测序。
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三种测序法比较
3 个平台的测序方法虽然各具特点，但在原理上有 很多的共同之处主要表现为: 可将目标 DNA剪切为小片 段; 单个小片段 DNA 分子结合到固相表面;进行单分子 独立扩增; 每次只复制一次并检测信号; 具有高分辨率 的成像系统; 高的输出量和高解析度。