最新分子生物学常用技术

DNA marker
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DNA 长度标准曲线
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4. 电泳缓冲液
▪ Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 ▪ Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 ▪ Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
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5. 样品制备
▪ 上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯青
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点样
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▪ 凝胶电泳的种类
– 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis) ▪ 分离核酸原理 ▪ 操作要点 ▪ 应用范围
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2.分子筛效应
▪ 小分子移动快 ，大分子移动慢
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3. 分子构象
-
+
▪ 闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
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2. 凝胶浓度的选择
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凝胶的制备
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第十七章 分子生物 学常用技
术
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分子生物学常用技术
▪ 凝胶电泳 ▪ 分子杂交 ▪ 聚合酶链反应(PCR)技术 ▪ DNA的物理图谱 ▪ DNA序列测定 ▪ 基因芯片
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7.电泳染色
▪ 溴乙锭(ethidium bromide, EB) ▪ 结构及染色原理 ▪ 染色方法
– 加入凝胶液中 – 电泳结束后染色
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EB染色原理
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（二）操作要点
▪ 支持物 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ DNA分子量标准 ▪ 电泳缓冲液 ▪ 样品制备 ▪ 电泳条件 ▪ DNA电泳染色 ▪ DNA片段的回收
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（三）应用范围
▪ DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定
1. 支持物
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商品化的琼脂糖
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琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
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紫外灯下显色
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8. DNA片段的回收
▪ 低熔点琼脂糖法 ▪ 透析袋电洗脱法(>5kb) ▪ DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
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3. DNA marker
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（一）分离核酸原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应 ▪ 分子构象
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1. 电荷效应
▪ 核酸是两性电解质
▪ pH = 3.5 ,
正电荷
▪ pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
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6.电泳条件
▪ 潜水电泳 ▪ 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
▪ 温度：15~25℃
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潜水电泳
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第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
▪ 电泳概念 ▪ 基本原理
Q μ＝
6πrη
μBiblioteka Baidu 迁移率
Q : 电荷量
r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度
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▪ 电泳的用途
– 分离 – 鉴定纯度 – 测定分子量