流式常用荧光染料概要

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流式荧光染色法实验原理及步骤

流式荧光染色法实验原理及步骤原理：荧光染料CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。

当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。

这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

实验步骤，以小鼠脾细胞为例：1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。

流式细胞术中应用的荧光染料介绍

流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。

在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。

荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。

以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。

1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。

FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。

它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。

2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。

PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。

PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。

3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。

APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。

5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。

它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。

除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。

例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。

这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。

需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。

分子生物学常用荧光核酸染料

由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。

这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。

除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。

根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。

生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。

分子生物学常用荧光核酸染料荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。

EBEB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。

因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。

EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。

前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。

EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。

虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。

偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。

生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。

SYBR系列染料说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。

自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。

这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。

常见荧光染料及用途

常见荧光染料及用途《常见荧光染料及用途》荧光染料是一种能够吸收可见光或紫外光，并在吸收能量的激发下发射可见光的化学物质。

它们的应用非常广泛，涵盖了许多领域，例如生物医学、材料科学、环境监测等。

以下介绍几种常见的荧光染料及其主要用途。

1. 墨水蓝(BR)：墨水蓝是一种具有强烈蓝色荧光的染料，常用于生物实验中的DNA染色。

它与DNA结合后能发出强烈的荧光信号，从而在实验中方便地观察和分析DNA的存在和定位。

2. 罗丹明B(RhB)：罗丹明B是一种红色荧光染料，广泛用于组织切片和细胞染色。

它能够与细胞核和胞浆中的核酸结合，以显示细胞和组织的结构，帮助科研人员研究细胞分裂和组织结构变化。

3. 草酸罗丹明G(OG)：草酸罗丹明G是一种绿色荧光染料，主要应用于蛋白质和核酸的定量分析。

在分光光度计中配合荧光检测器使用，可以精确测定溶液中蛋白质和核酸的浓度。

4. 罗丹明110(Rh110)：罗丹明110是一种黄绿色荧光染料，常用于细胞活性检测。

通过与细胞内的酶或细胞膜结合，罗丹明110可以用来评估细胞的活力和存活情况，特别适用于细胞毒性测试和细胞增殖研究。

5. 荧光素(FITC)：荧光素是一种与生物相容性极高的荧光染料，常用于免疫染色和分子生物学实验。

它能与抗体特异性结合，在免疫组化和流式细胞术中用于检测蛋白质的表达以及细胞表面标记。

以上只是常见的荧光染料中的几种，它们的应用还远不止于此。

随着科学技术的不断进步，新型的荧光染料不断问世，为各个领域的研究提供了更多更有力的工具。

通过荧光染料的运用，科学家们能够更好地理解和研究生物、物质和环境，进一步推动科学的发展。

干货满满！荧光染料大总结！

干货满满！荧光染料大总结！荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。

在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。

为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。

此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。

本文就对几种常用的荧光剂进行了具体的介绍。

免疫荧光 (IF)在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。

有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。

比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。

此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。

荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。

因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。

然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。

免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。

最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。

这种方法被称为“直接免疫荧光法”。

在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。

第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。

第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。

这种方法被称为“间接免疫荧光法”。

这种方法存在诸多优势。

一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。

另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。

常用荧光染料的激发和发射波长

常用荧光染料的激发和发射波长荧光染料广泛应用于生物医学、材料科学、光电子学等领域，其特点是在受到激发后会发出可见光，具有较高的荧光量子产率和灵敏度。

在实际应用中，荧光染料的激发和发射波长显得尤为重要，因此本文将整理常用荧光染料的激发和发射波长，方便读者在实验或研究中的选择。

常用荧光染料1. FITC （荧光同型素-异硫氰酸酯）FITC是一种广泛应用于生物学实验的荧光染料，常用于标记蛋白质、抗体、药物等分子，其最大吸收波长和最大发射波长分别为495 nm和519 nm。

FITC的分子量小，荧光量子产率高，这使得它成为一种理想的荧光标记分子。

2. Rhodamine 123Rhodamine 123是一种阳离子荧光染料，可在细胞中标记线粒体，同时也可在许多生物学应用中标定其他细胞器。

Rhodamine 123的最大吸收波长和最大发射波长分别为507 nm和529 nm，其荧光量子产率高，荧光亮度高。

3. Texas RedTexas Red是一种常用的激发波长长达596 nm的荧光染料，在荧光共振能量转移等实验中被广泛应用。

Texas Red的最大发射波长在610 nm左右，其在荧光共振能量转移实验中能够提供强烈的荧光标记。

4. PE （腺苷酸酰基酯）PE是一种被广泛用于流式细胞仪实验中的荧光染料，其最大激发波长为488 nm，最大发射波长在575 nm左右。

PE作为一种非常亮的荧光染料，可用于标记和鉴定特定类型的细胞。

荧光染料的选择在实验或研究中，需要根据具体的情况选择合适的荧光染料。

对于激发波长和发射波长的选择，一些因素应该被考虑，如：•研究对象的荧光信号贡献；•其他染料的交叉激发和发射波长；•激发和发射波长的设备可用范围。

一般来说，应选择滤光片相对集中并且有较高吸收的荧光染料，以确保设备需要的能量和检测返回信号的量达到最大程度。

总结本文简要介绍了几种常用的荧光染料及其特性，这些荧光染料可以分别从不同角度用于生物学、光学、材料学等领域的研究和实验中。

常用抗体标记荧光染料的选择

1、蓝色（350-450nm处激发）CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等----亮蓝和紫外光激发。

CF350是类似于Alexa Fluor 350和传统荧光染料AMCA的蓝色荧光染料，CF350的荧光强度高于Alexa Fluor350、AMCA，吸附在蛋白上的荧光超过50%，水溶性更好，耐光性非常优秀亮，更容易与现有的绿色荧光基团区分。

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405 ----近乎完美的匹配蓝色二极管激光器。

CF 405S/ CF 405 M、Alexa Fluor 405与近来使用的荧光显微镜和流式细胞仪405nm;谱线的蓝色二极管激光器完美的匹配。

在流式细胞仪上的分析结果显示CF 405S/ CF 405 M荧光信号强度高于Alexa Fluor 405染料1.7倍。

2、绿色（488nm处激发）CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----针对488nm 氩离子激光器的绿色荧光染料。

以上染料其标记的抗体蛋白适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪，流式细胞仪的FL1通道检测，或者可用于荧光显微镜技术。

CF 488A最低限度的带电量降低了与抗体耦联物的非特异性结合，在红色通道溢出少于Alexa Fluor 488，耐光性好、水溶性好和pH 不敏感，良好的稳定性和活性染料的标记率。

Alexa Fluor 488在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4~10）；FITC激发波长488nm，最大发射波长525nm，缺点：荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

3、橙红色（543-555nm处激发）CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550, Cy 3, DyLight 549, Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色荧光染料；CF ™543 荧光条带明亮，耐光，水溶性好，确保了CF 543染料与抗体的耦联物保持优异的水溶性，为该波段最亮的橙色荧光染料。

转染荧光细胞流式-概述说明以及解释

转染荧光细胞流式-概述说明以及解释1.引言1.1 概述转染荧光细胞流式是一种重要的实验技术，它结合了转染技术、荧光探针和流式细胞术的优势，能够实时监测和定量分析目标细胞内特定蛋白或基因的表达水平。

该技术在生物医学、生命科学和临床研究中具有广泛的应用价值。

通过转染，即将外源DNA或RNA引入目标细胞，可以使目标细胞表达特定的荧光蛋白。

这些荧光蛋白具有特定的光谱特性，可以发出明亮的荧光信号。

在流式细胞术中，荧光信号可以被敏感的流式细胞仪所检测和分析，实现单个细胞的高通量检测。

转染荧光细胞流式的应用范围非常广泛。

首先，它可以用于细胞信号转导通路的研究。

通过将特定的信号通路相关蛋白转染至细胞中，并标记荧光，可以实时观察这些蛋白的定位、相互作用以及调控等信息，揭示细胞内信号传递的机制。

其次，转染荧光细胞流式在基因表达调控研究中也起到重要作用。

通过转染载有特定基因或RNA的载体，可以实现该基因或RNA的高效表达。

结合荧光标记，可以定量分析该基因或RNA的表达情况，探究其在细胞内的功能和调控网络。

此外，转染荧光细胞流式还在肿瘤学、免疫学和神经科学等领域发挥着重要的作用。

通过转染荧光标记的抗体或靶向探针，可以定量分析肿瘤细胞的表面标志物、免疫细胞的表型和功能以及神经细胞的发育与变化等重要信息。

然而，转染荧光细胞流式也存在一些局限性。

例如，转染效率不高、特定蛋白的荧光标记可能造成其结构和功能的改变等。

此外，对于某些细胞类型，由于其鲜明的荧光背景或细胞增殖的影响，可能会干扰荧光信号的准确检测。

综上所述，转染荧光细胞流式技术具有广泛的应用前景和重要的研究意义。

未来的发展方向包括改进转染方法，提高转染效率和特异性；开发更多种类和用途的荧光探针；完善流式细胞仪的检测和分析能力；结合转染荧光细胞流式技术与其他高通量技术的综合应用，共同推动细胞生物学和医学研究的发展。

1.2文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：在文章结构部分，将会介绍本文的整体架构和各个章节的内容安排。

【技术资料】多色流式实验荧光素的选择

【技术资料】多⾊流式实验荧光素的选择近⼗年来流式细胞仪已经成为临床医⽣、免疫学家和细胞⽣物学家必不可少的⼯具，这项技术在不断进步。

流式细胞仪的多参数细胞分析这⼀独特的功能让⼤多数细胞分析成为了可能。

Coon⾸先提出了荧光抗体标记细胞内的⽬的蛋⽩技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单⼀的细胞表⾯标志物来确定，使⽤的单抗和荧光素很受限制。

基因表达技术的诞⽣和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。

1. 常⽤荧光素的种类及特性1）. FITC（Fluorescein）⼜称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；FITC的最⼤发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。

2). PE（R-Phycoerythrin）⼜称藻红蛋⽩，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE的最⼤发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。

3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR⼜名ECD，是由PE和TexasRed（TR）组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-TR的最⼤发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

4). PI（PropidiumIodide）⼜称碘化丙啶，其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PI的最⼤发射波长为617nm。

在流式细胞仪的FL3通道检测。

5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）⼜称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合⽽成的Tandem荧光素；其标记的抗体适⽤于所有配备488nm氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最⼤发射波长为670nm，在流式细胞仪上⽤FL3通道检测；PE-Cy5标记的抗体可⽤于毫⽡级激光器的⼩流式细胞仪，也适⽤于配备有全功率激光器的⼤流式分选仪。

流式细胞术中应用的荧光染料介绍

流式细胞术中应⽤的荧光染料介绍当我们在进⾏多⾊流式分析的时候，对分析成功的⼀个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。

通常会有很多可⾏的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。

对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪⽐相差四到六倍都取决于荧光素的使⽤。

相对的荧光强度也取决于使⽤的仪器。

⾼密度表达的抗原我们可以应⽤任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应⽤⾼信噪⽐⾼的荧光素，譬如PE或者APC标记的抗体来充分检测分离出阳性表达的细胞与阴性表达的细胞。

⾃发荧光个别的细胞有着他们各⾃特异性⽔平的⾃发荧光（荧光信号产⽣于他们⾃⾝）。

当在全波长荧光通道中进⾏观察的时候，⾃发荧光信号在长波长（>600nm）明显的降低。

对于有较⾼⽔平⾃发荧光类型的细胞，如长期组织培养的细胞，应使⽤较⾼发射波长的荧光染料（APC、APC-Cy7等）标记抗体，通常他们会有⼀个较好信噪⽐的结果。

对于那些不是有较多⾃发荧光类型的细胞，如新鲜的细胞，可以使⽤FITC 标记的抗体了。

以下为各种常⽤荧光素介绍：Alexa Fluor 488 has a spectrum almost identical to that of fluorescein isothiocyanate (FITC), but with extraordinary photostability. Because of this photostability, it has become a choice for fluorescent microscopy applications and has become popular in cytometry applications. It is detected in the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. Unlike other fluorochromes with similar emission spectra, Alexa Fluor 488 is pH insensitive over a broad range.Alexa Fluor 633 is a practical alternative to APC as well as Cy5. Alexa Fluor 633 conjugates can be used in multi-color flow cytometry with instruments equipped with a second red laser or red diode. It is detected in the FL4 detector of the FACSCalibur. The FACScan cannot be used to detect Alexa Fluor 633 conjugates because the FACScan lacks a red laser or diode. Like other Alexa Fluor dyes, Alexa Fluor 633 exhibits uncommon photostability, making it an ideal choice for fluorescent microscopy.A great number of different Alexa Fluor dyes exist that are beyond the scope of this introductory fluorophore section. Many manufacturers sell directly-conjugated Alexa Fluor antibodies. Know that Molecular Probes' Zenon Antibody Labeling Kits, which are available for all of their Alexa Fluor dyes, make it possible to rapidly and quantitatively label antibodies from a purified antibody fraction or from a crude antibody preparation such as serum, ascites fluid or a hybridoma supernatant. See /servlets/publications?id=150 for specifics.Allophycocyanin (APC) is an accessory photosynthetic pigment found in blue-green algae. APC has 6 phycocyanobilin chromophores per molecule, which are similar in structure to phycoerythrobilin, the chromophore in phycoerythrin or PE. APC tandem dyes, APC-Cy5.5 and APC-Cy7, are also available. APC has a 650-nanometer wavelength absorption maximum and a 660-nanometer fluorescence emission maximum. APC can be used in flow cytometers equipped with dual lasers for multi-color analysis. Like Alexa Fluor 633, APC is excited using the helium-neon red diode laser (633 nanometers) of the FACSCalibur and is detected on the FL4 detector. APC cannot be detected on the FACScan as that instrument is not equipped with a red laser.APC-Cy7 is a tandem conjugate system that combines APC and a cyanine dye (Cy7) and has an absorption maximum at~650 nanometers. This tandem uses the efficiency of the fluorescence light energy transfer between the two fluorochromes. When excited by light from a helium-neon laser, the excited fluorochrome (APC) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength. The resulting fluorescent emission maximum is in the deep red at approximately 767 nanometers. APC-Cy7 run on a FACSCalibur results in dim expression because the FL4 detector's optical filter is centered for APC emission (660 nanometers) and not the longer red wavelengths excited with the helium-neon diode. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Carboxyfluorescein Diacetate (CFSE) can be used to track asynchronous cell division. Cell division results in sequential halving of the initial fluorescence, resulting in a cellular fluorescence histogram.The peaks labeled 1, 2, 3, 4 and 5 represent successive generations of CFSE-cultured cells.Cy3 and Cy5 are excited by the 488-nanometer line of an argon laser and the 633-nanometer line of a helium-neon diode or laser, respectively. These conjugates can be used in flow cytometry but typically do not give the fluorescence intensity comparable to that of PE or APC. Applications where a smaller dye is required are more appropriate for these dyes. These fluorochromes are well suited for fluorescent microscopy.Enhanced Cyan Fluorescent Protein (eCFP) cannot be analyzed using the FACScan or FACSCalibur as this molecule requires excitation in the violet range. The protein is easily detected using the violet laser of the LSRII, or the violet lines of the MoFlo's argon or krypton lasers. This molecule has an excitation maximum at 475 nanometers and is best excited using the MoFlo's 457nm line of the argon or argon-krypton mixed gas laser. Use of the 407nm violet laser of the LSRII will result in weak eCFP expression. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) can be excited at 488 nanometers with a peak emission at 509 nanometers and is detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. The MoFlo and LSRII are able to distinguish between concurrently expressing eGFP and eYFP cells if the proper optical filters and experimental controls exist. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins. Enhanced Yellow Fluorescent Protein (eYFP), a yellow-shifted variant of the eGFP molecule, is also excited at 488 nanometers with a peak emission at 535 nanometers and is also detected in the FL1 detector on the FACSCalibur or FACScan. More detailed discussion of this molecule can be found in the next section of this web site, the section on Fluorescent Proteins.Fluorescein isothiocyanate (FITC) is currently the most commonly used fluorescent dye for flow cytometry analysis. When excited at 488 nanometers, FITC has a green emission that's usually collected at 530 nanometers, the FL1 detector of the FACSCalibur or FACScan. FITC has a high quantum yield (efficiency of energy transfer from absorption to emission fluorescence) and approximately half of the absorbed photons are emitted as fluorescent light. For fluorescent microscopy applications, FITC is seldom used as it photobleaches rather quickly though in flow cytometry applications, its photobleaching effects are not observed due to a very brief interaction at the laser intercept. FITC is highly sensitive to pH extremes.Peridinin chlorophyll protein (PerCP) has a 677 nanometer maximum emission, red, when excited at 488 nanometers and is detected on the FL3 detector of the FACSCalibur or FACScan. A PerCP tandem dye is also available (PerCP-Cy5.5). PerCP is not suited for the high-powered lasing (>150mW) applications, such as on the MoFlo, due to its photobleaching characteristics. PerCP conjugates can only be obtained from Becton Dickinson and its subsidiary, Pharmingen. Phycoerythrin (PE or R-PE) has a huge absorption coefficient and almost perfect quantum efficiency. In vivo, it functions to transfer light energy to chlorophyll during photosynthesis. It is one of the brightest dyes used today and emits in theyellow/orange at about 570 nanometers. Those accustomed to fluorescent microscopy may not be familiar with this fluorochrome as it photobleaches rather quickly under a microscope.Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) is a tandem conjugate where PE is coupled to the cyan dye, Cy5. When excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the cyanine molecule, which then fluoresces at a longer wavelength in the red at 670 nanometers. This tandem dye is known by a confusing myriad of names to include Becton Dickinson's CyChrome, Caltag and Sigma's Tri-Color, GIBCO's RED670, Coulter's PC5, and probably others. Other PE conjugates exist, e.g., PE-Cy5.5 and PE-Cy7, that will not be discussed in this introductory fluorophore section. It is recommended that special precautions be taken with this conjugate, and cells stained with them, to protect the fluorochrome from long-term exposure to visible light.Phycoerythrin-Texas Red (PE-Texas Red) is a tandem conjugate where PE is coupled to Texas Red. Similar to other tandem conjuates, when excited by 488-nanometer light, the excited fluorochrome (PE) is able to transfer its fluorescent energy to the Texas Red molecule, which then fluoresces at a longer wavelength with a peak in the orange at 612 nanometers. This tandem is also known by other names such as Red 612 and ECD (Electron Coupled Dye). Know that PE-Texas Red conjugates run on the FACScan or FACSCalibur will result in dull expression due to the extant optical filters. This is not observed on the LSRII or MoFlo when equipped with the appropriate optical filters for this conjugate. There is considerable overlap of emission when running PE and PE-Texas Red specimens.Propidium Iodide (PI) is a membrane-impermeant dye that stains by nondiscriminately intercalating into every 4th or 5th nucleic acid base pair, binding both DNA and RNA. Once bound, PI undergoes a conformational change and becomes ~40 times brighter. Propidium iodide has a broad emission spectrum with a peak in the orange at 620 nanometers. A number of assays employ propidium iodide. Cells or nuclei with altered DNA content are identified by staining alcohol-fixed, RNAse-treated cells or nuclei with this dye (see below).The first peak (M1) on the left represents normal diploid cells. The next major peak (M2) represents tumor cells with increased DNA content and DNA index of 1.27. Propidium iodide can be combined with additional fluorescent antibodies that are specific for a unique cell population and allow for more accurate S phase analysis of multiple overlapping populations.Propidium iodide has also been employed for many years as a marker for viability as the disrupted membranes of dead cells allow the dye to pass freely to the nucleic acids. However, this dye is very sticky; it will stick to sample tubing and, given sufficient time exposure to living cells, living cells will appear to be propidium iodide positive. Given this dye's broad emission spectrum and its sticky properties, contemporary flow cytometry labs have replaced propidium iodide with other nucleic acid dyes, e.g., 7-AAD (listed below), TO-PRO-3, or DAPI, among many others, for viability measurements though propidium iodide remains the most commonly used dye for DNA content analysis.Texas Red has an excitation maximum in the yellow-orange range of the color spectrum; consequently, Texas Red cannot be excited on any of the benchtop analyzers in the core facility. It can, however, be detected using one of green laser lines of the MoFlo's argon laser but ideally using the yellow laser line of the MoFlo's krypton laser. When excited, Texas Red has an excitation maximum in the orange at 612 nanometers.7-Aminoactinomycin D (7-AAD), like propidium iodide, is a DNA intercalating dye but 7-AAD is specific for C-G base pairs. It is well suited for viability measurements and also for apoptosis experiments where it's paired with Annexin V. Unlike propidium iodide, this dye has minimal emission bleed from the FL3 detector into the FL2 (PE) detector on the FACSCalibur or FACScan. Whereas PI can be detected in either FL2 or FL3, though it is typically detected in FL2, of the FACScan or FACSCalibur, 7-AAD is detected in FL3.PE：Phycoerythrin 藻红蛋⽩；488nm，575nm（橙红）FITC，异硫氰酸荧光素 488nm，525nm（绿APC：英⽂全名：allophycocyanin，中⽂名：别藻青蛋⽩，最⼤吸收峰：650nm，最⼤发射荧光峰：660nm，适⽤于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。

流式细胞术多色荧光分析指南

流式细胞术多色荧光检测是目前精细鉴定细胞亚群及分析不同细胞亚群功能的重要手段，在国际和国内均得以广泛应用。

然而，面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间的颜色补偿究竟有多大呢？下面提供两个表格谨供参考，希望能给您带来一丝感悟。

1荧光素激发波长 (nm) 发射波长(nm) 长通滤片带通滤片eFluor TM450 405, 407 450 -- 440/40, 450/50Pacific Blue 405, 407 455 -- 440/40, 450/50eFluor TM605NC355, 405, 407 605 595LP 605/40eFluor TM625NC355, 405, 407 625 595LP 605/50eFluor TM650NC355, 405, 407 650 630LP 660/40FITC 488 518 -- 530/30Alexa Fluor® 488 488 519 -- 530/30PE 488 575 550LP 575/26, 585/40PE-Cy5 488 667 635LP 670/14, 695/40PE-Cy5.5 488 695 685LP 695/40PerCP-Cy5.5 488 695 685LP 695/40, 710/40PE-Cy7 488 785 735LP 780/60, 780/40APC 633, 635, 640 660 -- 660/20Alexa Fluor® 647 633, 635, 640 668 -- 660/20Alexa Fluor® 700 633, 635, 640 723 685LP 710/40, 710/50, 720/45 APC-eFluor TM780 633, 635, 640 780 735LP 780/60APC-Alexa Fluor® 750 633, 635, 640 775 735LP 780/60 注释:1.以eFluor TM450为例: 最大激发波长为405 nm或407 nm, 最大发射波长为450 nm, 流式细胞仪检测时无需长通滤片(LP, Long Pass), 而需440/40 (即检测波长范围为440 + 20 nm)或450/50 (即检测波长范围为440 + 25 nm)的带通滤片 (BP, Band Pass)。

流式细胞仪试剂介绍

如何读懂荧光标记的单克隆抗体
Mouse anti-Human CD3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 Mouse Mouse: 抗体来源----小鼠 Anti-Human: 检测对象为人类细胞 CD3-FITC: 检测CD3的抗原, 该抗体为FITC荧光素标记 UCHT1: 抗体的Clone 株 IgG1 Mouse: 为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴
CD3 ECD CD3 PC5
CD3 PC7
Performance
Vendor ‘X’
Vendor ‘Y’
Clear Resolution of Cellular Sub-sets
Performance Matters: Impact Of Photo-degradation
Control, t0
Finished Tandem Dye Three Lot Comparison of PC7
250
Performance
Fluorescence Intensity
200
150
Lot # 3021-101 Lot # 1828-47 Lot # 1828-95
100
50
0 550 600
Emission Wavelength (nm)
性对照应为Mouse IgG1-FITC
如何看懂试剂的说明
临床试剂
RD1=PE
标记的荧光素
试剂包装规格大小
如何看懂试剂的说明
科研试剂
科研试剂，以mg/g表示试剂包装大小，需要做滴度实验，摸索最佳实验所需试剂量
如何看懂试剂的说明－试剂的货号识别
6开头的试剂为美国库尔特生产

流式细胞术的染料基本要求-概述说明以及解释

流式细胞术的染料基本要求-概述说明以及解释1.引言1.1 概述流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，它可以快速、准确地检测和分析细胞中的各种组成成分。

在流式细胞术中，染料的选择和使用是非常关键的，它直接影响到实验的结果和准确性。

因此，了解染料的基本要求对于开展流式细胞术研究至关重要。

首先，染料的选择要符合实验的目的和需要。

不同的细胞成分需要使用不同的染料进行标记，比如细胞膜表面标志物需要使用荧光标记染料，细胞内的DNA或RNA则需要使用核色素染料进行标记。

因此，在选择染料时，需要根据实验的研究对象和要解决的科学问题来决定使用什么样的染料才能达到最佳效果。

其次，染料的浓度和处理方法也是十分重要的。

染料的浓度应该适中，过高或过低都会对实验结果产生影响。

浓度过高可能导致非特异性标记或背景信号过强，而浓度过低则可能导致信号弱化或者检测不到。

此外，还需要注意染料的稳定性，某些染料可能会受到光照、温度等因素的影响而失去活性，因此在实验前需要充分了解染料的储存和处理方法，以确保其在实验过程中的稳定性和准确性。

总之，流式细胞术的染料基本要求包括选择符合实验目的和需要的染料以及合理控制染料的浓度和处理方法。

只有在满足这些要求的前提下，才能确保流式细胞术实验的准确性和可靠性。

对于未来的研究，可以进一步研究和开发更为稳定和高效的染料，并探索更多新的染料应用于流式细胞术中，以提高该技术在细胞学研究中的应用和发展。

文章结构的设计是为了使文章内容有条理、清晰、易于阅读和理解。

在本文中，文章结构的设计主要围绕着流式细胞术的染料基本要求展开。

下面是文章结构的详细描述：1.2 文章结构本文主要由引言、正文和结论三个部分组成。

1. 引言部分简要介绍了流式细胞术以及染料在其中的作用。

首先，概述了流式细胞术在生物医学研究中的重要性和应用范围。

然后，概括性地说明了文章的整体结构，并指出了引言、正文和结论的内容和目的。

最后，阐述了本文的目的，即探讨流式细胞术中染料的基本要求。

流式常用荧光染料概要

如何选择流式细胞仪测定常用的荧光染料流式细胞仪测定常用的荧光染料有很多种，我们如何来选择流式细胞仪测定的常用荧光染料呢？首先要考虑，他们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也不同，选择荧光染料时，必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长做为重点考虑。

发射光波长，如：氩离子气体激光管，它的发射光波488nm氦氖离子气体激光管发射光波长633nm488nm激光光源常用的荧光染料有FITC （异硫氰酸荧光素）；PE （藻红蛋白）PI （碘化丙啶）CY5 （化青素）preCP（叶绿素蛋白）ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）等。

流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器Hoechst 33342 Hoechst 33258 DAPI ndo-1 F |T C PE_CY5 480 PE_CY5.5 480 PerCP 490 Alexa Fluor 488 494PE_Texas Red 480Rhodamine 123 500 Fluo-3 506DiOC6(3) 480PE 80 YOYO-1 90:x 波长（nm ） m 波长(nm)355DNA 染色365核酸标记372 细胞内钙离子标记350 405 490 标记抗体517 13520 578・540 ■激光器351nm紫外激光器488nm线粒体标记 APC CY5细胞内钙离子标记内质网标记■ 510 [■DNA 染色 ropidium Iodide 核酸标记Acridine Orange 90 650 633nmAlexa Fluor 647 650 氦氖激光器650.60标记抗体流式掘田胞仪交流论坛：/forum-181-1.ht mlIndo-1 361/330490/4051010AM ester. Low/High Ca++,Fluo-3 506526855AM ester. pH > 6DCFH 5055355292'7'Dichorodihydrofluorescein, oxidized formDHR 50553434 6Dihydrorhodamine 123, oxidized form,light catalyzes oxidationSNARF 548/579 587/635pH 6/9荧光蛋白 360Y66H 360 508Y66F EBFP 38044018EBFP2 383 448Azurite 383 447GFPuv 385 508T-Sapphire 399511475Cerulean 475mCFP 477ECFP 477CyPet 485Y66WQYPSBR 0.monomer27monomermonomer0.weak dimer600.620.monomer400.150.weak dimer 51weak dimer。

流式细胞所用试剂配置及荧光特性

一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。

5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。

应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4•7H2O 2gKCl 8gMgCl•6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4•12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。

hochest 染色及流式

hochest 染色及流式Hochest染色及流式染色技术在生物学和医学领域中起着重要作用，其中Hochest染色是一种常用的荧光染色方法。

Hochest染料是一类荧光染料，常用于细胞和组织的核酸染色。

本文将介绍Hochest染色的原理和应用，并结合流式细胞术探讨其在生物研究中的意义。

让我们了解一下Hochest染色的原理。

Hochest染料是一类DNA特异性染料，可以通过与DNA双链结合来发射荧光。

Hochest染料有多种不同的类型，如Hochest 33342和Hochest 33258等。

这些染料都具有很高的DNA亲和力，能够与DNA的碱基序列发生相互作用，从而实现染色的效果。

Hochest染色在细胞和组织学研究中具有广泛的应用。

首先，Hochest染色可以用于检测细胞核的形态和数量。

通过将Hochest 染料与细胞一起处理，可以使细胞核发出荧光信号，从而观察和分析细胞核的形态和数量变化。

这对于细胞周期研究、细胞增殖和凋亡等过程的研究非常重要。

Hochest染色还可以用于染色体分析。

在细胞分裂过程中，可以使用Hochest染色来观察和分析染色体的形态和数量变化。

这对于研究染色体异常、染色体结构和功能等方面具有重要意义。

此外，Hochest染色还可以用于研究DNA损伤和修复、DNA合成和复制等过程。

除了Hochest染色技术本身，流式细胞术也是一种常用的生物研究技术。

流式细胞术利用荧光染料标记的细胞或细胞器，通过流式细胞仪进行检测和分析。

结合Hochest染色和流式细胞术，可以更精确地分析细胞核的形态和数量，进一步研究细胞的生物学特性。

流式细胞术在生物研究中有着广泛的应用。

首先，流式细胞术可以用于细胞表型分析。

通过荧光染料标记的抗体，可以对细胞表面标记物进行定量分析，如细胞膜蛋白、细胞间连接蛋白等。

这对于研究细胞分化、细胞功能和细胞亚群的分离非常重要。

流式细胞术还可以用于细胞周期分析。

通过Hochest染色和荧光染料标记的抗体，可以对细胞周期不同阶段的细胞进行定量分析。

BrilliantViolet多色流式介绍

355
496
515/30
Brilliant Violet BUV661
Bright
348
355
661
670/25
Brilliant VioletBUV737
Bright
348
355
737
740/35
Brilliant Violet BUV805
Dim
348
355
805
820/60
三、BD HorizonTM Brilliant Blue 515 （BB515）
5）BV 染料和 BD FACS Buffer 很好的兼容性保证能用于各种流式实验，无毒，适合做流式分选及活细胞成像
二、BUV家族BD Horizon Brilliant UltraViolet (BUV Family)
1、家族成员BUV395 BUV496 BUV737 BUV805荧光素图谱
2、各BUV荧光素信息详细介绍
3、BV421明星product介绍
BD Horizon BV421 的亮度相当于 PE 或比 PE 还要亮，比 Pacific Blue 亮 10 倍
更亮，更好的分辨率，弱表达抗原的第一选择，让 Pacific Blue 通道变得wonderful
BV421染色案例数据
4、Brilliant Violettm 染料标记流式抗体优势
710/50
Qdot705, eFluor700NC
Brilliant Violettm786
Bright
407
405
786
780/60
Qdot800
Brilliant Violet tm450
Dim
404