土壤中产酸菌的筛选及其对重金属生物有效性影响_杨卓

筛菌用土：取自河北省安新县北际头乡，府河入 白洋淀处。此处土壤已受到重金属污染，其中 Cd 含量 超出了《土壤环境质量标准》（GB 15618-2008）的三 级标准。实验用土主要理化性质见表 1。污染土中有效 态 Pb、Cd、Zn 含量分别为 15.68、1.72、62.37 mg/kg。 1.2 试验方案与布置 1.2.1 土壤中产酸菌的筛选
Abstract：This paper，based on microbial screening and pot experiment，studies the influence of indigenous acid-producing microorganisms on absorption of heavy metal of Brassica juncea in contaminated soil. The selected acid-producing microbes with activation or passivation are strain identified and product analyzed. 28 acid -producing strains are found through screening，and the strains labeled A -4 -2，b -1 -0，c -5 -5，and c -4 -0 fairly promote the absorption of heavy metal of Brassica juncea. Meanwhile， strain labeled b -3 -7 restrains absorption of heavy metal of Brassica juncea. After phytophysiology and biochemistry analysis and extraction and purification and sequencing of 16S rDNA ，the strains are shown as Listeria denitrificans（c-4-0），Bacillus cirallans（b-1-0），Listeria grayi（c-5-5），and Neisseria sicca（b-3-7）. Analysis with reversed-phase high performance liquid chromatography，indicates that oxalic acid，tartaric acid and malic acid are found in metabolito of zymotic fluid, all of which are low molecular weight organic acids, which would affect the existing form of heavy metal, namely biological effectiveness, and further affect the absorption of plants on heavy metal. Key words：Brassica juncea；phytoremediation；combined pollution；heavy metal；microbiology；screening
土壤是人类赖以生存的物质基础，土壤污染危害 极大，它可以导致粮食减产，并且通过食物链影响人 体健康。土壤重金属污染是指重金属进入土壤中，使 原有土壤中重金属含量显著升高，从而造成土壤生态 环境恶化的结果或现象[1]。利用土壤中微生物的代谢
产物或微生物自身的生物活性，对污染元素进行吸 附，或转化为低毒产物，从而减轻重金属污染的程度 是目前进行土壤修复的一个方向[2-4]，这种方法应用难 度较大，目前尚处于实验研究阶段。土壤微生物是土 壤组分中的活性组成成分，它代谢活动非常旺盛，带
第 37 卷 第 12 期 2014 年 12 月
Environmental Science & Technology
VoDl. e3c7.第N230o7.11卷24
杨卓，陈婧，李术娜． 土壤中产酸菌的筛选及其对重金属生物有效性影响［Ｊ］． 环境科学与技术，２０１４，３７（１２）：７８－８４． Ｙａｎｇ Ｚｈｕｏ，Ｃｈｅｎ Ｊｉｎｇ，Ｌｉ Ｓｈｕｎａ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ ［Ｊ］． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３７（１２）：７８－８４．
用实验用土制备样品稀释液，采用平板培养法培 养微生物，斜面培养基进行纯化培养。
筛选产酸菌，将酚酞指示剂加入培养基，恒温培 养 48 h，观察细菌的生长情况。 1.2.2 产酸菌对土壤中重金属生物有效性的影响
盆栽模拟试验：试验用塑料盆每盆装土 500 g，盆 栽用土风干后过 3 mm 筛子。重金属 Cd、Pb、Zn 分别 以醋酸盐固体粉末形式加入，制成 Cd 50 mg/kg、Pb 500 mg/kg、Zn 500 mg/kg 的污染土。施入分析纯 0.1 g 尿素和 0.2 g 二氨作底肥。加入蒸馏水使含水量为，保 持田间持水量 60%，10 d 后，播种，生长 7 d 后见苗。 15 d 后，施入筛选出的微生物发酵液 50 mL，设置不 加菌液的对照，每个处理重复 2 次，生长 80 d 后测量株 高、鲜重后收获。植物样品杀青、烘干、粉碎后测定Pb、 Cd、Zn。采用三酸消煮，原子吸收分光光度法测定。 1.2.3 产酸菌的菌种鉴定
YANG Zhuo1， CHEN Jing1， LI Shuna2
（1.Environalmental Management College of China，Qinhuangdao 066004，China； 2.School of Life Science, Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）
《环境科学与技术》编辑部：（网址）ｈｔｔｐ：／／ｆｊｋｓ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ（电话）０２７－８７６４３５０２（电子信箱）ｈｊｋｘｙｊｓ＠１２６．ｃｏｍ 收稿日期：2014-02-03；修回 2014-09-05 基金项目：2013 年度河北省科学技术研究与发展计划：重金属污染土壤原位微生物修复技术研究（13227504D） 作者简介：杨卓（1980-），女，副教授，博士，从事土壤环境质量评价与土壤修复等方面的研究，（电子信箱）yangzhuo315566@126.com。
本园 0~20 cm 的土壤，理化性质特征见表 1。
土壤类型
盆栽用土 筛菌用土
表 1 盆栽用土及筛菌用土的理化性质特征
Table 1 Characteristics of physical and chemical properties oห้องสมุดไป่ตู้ tested soil
重金属全量/mg·kg-1
Cd
Pb
本文试图从重金属污染土样中筛选能够产生低 分子量有机酸的微生物，通过盆栽试验验证其对植物 吸收重金属 Cd、Pb、Zn 的影响，对具有活化或钝化作 用的菌株进行菌种鉴定和产物分析，研究其在土壤重 金属污染修复方面的意义，为微生物促进植物修复重 金属污染土壤提供物质储备及基础性数据。
1 材料与方法
1.1 供试材料 供试植物：印度芥菜。 盆栽用土：采自中国环境管理干部学院校园内标
Zn
有机质/g·kg-1 全 N/g·kg-1 碱解 N/mg·kg-1 速效 P/mg·kg-1 速效 K/mg·kg-1
0.85 32.58 74.98
11.53
0.72
21.77
15.68
97.62
7.12 62.57 243.18
25.12
1.57
45.29
28.46
106.78
<0.01 mm pH 物理性黏粒 7.4 37.86% 7.9 29.12%
第 12 期
杨卓，等 土壤中产酸菌的筛选及其对重金属生物有效性影响
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正负电荷并且比表面积大。土壤中生活着多种耐重金 属的微生物，这些微生物通过不同作用方式影响着土 壤中重金属的生物有效性。微生物可以通过生物溶 解和沉淀作用、氧化和还原作用、菌根真菌固定作 用、吸附和富集作用、等方式改变土壤中重金属的存 在形态[5]。土壤微生物通过代谢作用可以产生多种低 分子量的有机酸，如甲酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸等。低 分子量有机酸在土壤中可以参与成土过程，能够促进 矿物溶解，改变根际土壤的理化性状，促进植物对养 分的吸收，降低重金属对植物的毒害等[6]。Siegel 等[7] 报道，真菌可以通过分泌氨基酸、有机酸以及其他代 谢产物溶解重金属及含重金属的矿物。
对筛选出来的对重金属活化和钝化效果最好的 菌株进行鉴定。参考《细菌分类学基础》[8]、《常见细菌 系统鉴定手册》[9]进行生理生化试验：甲基红试验、荧 光色素试验、葡萄糖氧化发酵试验、V.P 实验、硝酸盐
还原试验、丙二酸盐试验、柠檬酸盐试验、接触酶试 验、淀粉水解、糖类发酵试验、产糊精结晶试验、纤维 素分解试验、产胺试验、反硝化试验、苯丙氨酸脱氨酶 试验、色氨酸脱氨酶试验、牛奶分解试验、酒石酸盐利 用、精氨酸双水解酶试验、吲哚丙酮酸（IPA）测定。然 后进行 16S rDNA 的提取纯化及测序工作。 1.2.4 产酸菌的产物分析
关键词：印度芥菜； 植物修复； 复合污染； 重金属； 微生物； 筛选 中图分类号：X53 文献标志码：A doi：10.3969/j.issn.1003-6504.2014.12.016 文章编号：1003-6504(2014)12-0078-07
Screening of Organic Acids Producing Microbes and Their Effects on the Phytoremediation of Soils Contaminated with Heavy Metals
将微生物培养活化 1~2 次（28 ℃、4 d）后转接到 三角瓶培养（28 ℃、180 r/min、4 d）做 种 子 液 ，按 照 10%的接种量接种进行发酵培养。7 d 后去发酵液，将 菌体打碎后用无菌水稀释成菌悬液，用反高效液相色 谱进行产物分析比对。
仪器：高效液相色谱仪、紫外吸收检测器、旋转蒸 发仪、分析天平、酸度计等。
土壤中产酸菌的筛选及其对重金属生物有效性影响
杨卓 1， 陈婧 1， 李术娜 2
（1.中国环境管理干部学院，河北 秦皇岛 066004； 2.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071000）
摘 要：文章通过微生物筛选和盆栽模拟实验，研究了污染土壤中产酸菌对印度芥菜吸收重金属的影响，对土壤中筛选出的具有活 化或钝化效果的产酸微生物进行菌种鉴定和产物分析。实验共筛选得到产酸菌 28 株，通过盆栽试验，发现编号为 A-4-2、b-1-0、c-5-5、 c-4-0 的菌株对印度芥菜吸收重金属有很好的促进作用，编号为 b-3-7 的菌株对印度芥菜吸收重金属有抑制作用。对上述菌株进行生理 生化分析和 16S rDNA 的提取纯化及测序，它们分别为：c-4-0 为反硝化利斯特氏菌 （Listeria denitrificans），b-1-0 为环状芽孢杆菌 （Bacillus cirallans），c-5-5 为格氏利斯特氏菌（Listeria grayi），b-3-7 为干燥奈瑟氏球菌（Neisseria sicca）。将其发酵液经反向高效液相色 谱分析，发现这些菌株的发酵液代谢产物中含有草酸、酒石酸、苹果酸等低分子量酸物质，这些酸物质影响了土壤中重金属元素的存在形 态，即生物有效性，进而影响了植物对其吸收与利用。