Protocol蛋白质纯化步骤
蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
蛋白质纯化步骤
蛋白质纯化步骤蛋白质纯化，这可是个有趣又重要的事儿啊！就好像从一堆乱糟糟的杂物里找出你最宝贝的那个小物件一样。
首先呢，得准备好你的原料，这就好比要踏上旅程，得先有个出发地呀。
这原料可以是各种生物样本，比如细胞啦、组织啦等等。
然后呢，就是把这些原料进行破碎处理，让里面的蛋白质能跑出来，就像是打开一个神秘的盒子，让宝贝有机会现身。
接下来，就到了关键的一步啦，选择合适的方法来分离这些蛋白质。
这就好像在一个大集市里，要把你想要的东西挑出来。
可以用盐析法呀，就像是用一把特殊的筛子，把蛋白质筛出来；还有层析法，就如同让蛋白质们排队，按照它们的特点依次通过不同的关卡。
哎呀，这过程可不简单呢！每一步都需要精心操作，稍有不慎，可能就把珍贵的蛋白质弄丢啦。
就好像走钢丝一样，得小心翼翼的。
在纯化的过程中，还得注意各种条件哦。
温度啦、酸碱度啦，这些都像是蛋白质的小脾气，得顺着它们来。
不然它们一不高兴，可就不乖乖听话啦。
然后呢，经过一轮又一轮的筛选和分离，慢慢的，我们就能得到纯度比较高的蛋白质啦。
这感觉，就像是经过千辛万苦，终于找到了那传说中的宝藏一样令人兴奋！你想想看，从一开始那乱糟糟的一堆，到最后得到纯净的蛋白质，这是多么神奇的过程呀！这就好比把一块粗糙的石头，经过精心打磨，变成了一颗闪闪发光的宝石。
而且啊，蛋白质纯化的意义可重大啦！它可以帮助我们更好地了解蛋白质的性质和功能，为医学研究、药物开发等提供重要的支持。
这不就像是给我们打开了一扇通往未知世界的大门吗？总之呢，蛋白质纯化可不是一件容易的事儿，但只要我们用心去做，就一定能收获满满呀！就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！让我们一起加油，去探索蛋白质纯化的奇妙世界吧！。
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。
早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。
2、裂解液配制：：100：1，现配现用。
（100010）。
置入4℃冰上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。
一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、1 。
b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
c、将组织匀浆转入1.5的管中（管、离心管）。
12000 4°C 离心15。
d、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。
可-80℃保存。
4、蛋白浓度测定。
a、配工作液：溶液A：溶液50：1（200：4）。
*200；2*（1+1）*4。
需测试复孔。
标本X，则需Ac、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O，混匀。
即10倍稀释。
d、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃30。
注：应现加蛋白样本，再加工作液。
蛋白纯化protocol
诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB〔含抗性〕培养基中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５mlLB〔含抗性〕培养基的5 ml试管中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8〔最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr〕。
3、取局部液体作为未诱导的对照组,余下的参加诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在适宜温度下震荡培养４hr。
4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000g× 1 min收获沉淀，用４０µl 蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。
5、离心10000 g× 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-20 ℃或立即进展步骤2操作。
2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。
再参加1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
3) 10000 g，4℃离心20－30 min。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
二、层析1) 将处理好的NTA树脂装入适宜的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出局部，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值根本无变化4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。
常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。
此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质纯化实验流程
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1. 蛋白质样品，含有目标蛋白质的溶液，例如细胞裂解液、组织提取物或发酵液。
蛋白质分离纯化的方式
蛋白质分离纯化的方式分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。
为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。
组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。
细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。
如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。
2.粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。
一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。
有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。
3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。
蛋白纯化protocol
诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB（含抗性）培养基中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５ml LB（含抗性）培养基的5 ml试管中, 37 ℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8（最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养４hr。
4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000 g × 1 min收获沉淀，用４０µl蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。
5、离心10000 g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。
2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。
再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
二、层析1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。
许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。
到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。
且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。
蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。
因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。
其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。
对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。
同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。
另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
蛋白质分离纯化的一般步骤及主要技术
蛋白质分离纯化的一般步骤及主要技术嘿，咱今儿个就来聊聊蛋白质分离纯化这档子事儿！你可别小瞧了它，这可是个大学问呢！首先呢，得准备好咱的原料，就像大厨做菜得先有食材一样。
这原料里就藏着咱要的蛋白质，就等着咱去把它给揪出来。
然后就是破碎细胞啦！这就好比是拆房子，得把那包裹着蛋白质的“墙壁”给打破，让蛋白质能跑出来。
这可是个技术活，不能太轻也不能太重，得恰到好处才行。
接下来就是离心啦！这就像是个大力士，把那些不要的杂质给甩出去，留下咱要的蛋白质。
再说说过滤，这就像是个筛子，把大的杂质筛掉，让蛋白质能顺利通过。
然后就是提取啦！这可是关键的一步，就像从一堆沙子里找出金子一样，得有耐心，还得有技巧。
这其中的主要技术呢，有电泳技术。
你想想，蛋白质就像一群小人儿，在电场里跑啊跑，根据它们的特点，就能分出来啦！还有层析技术，这就像走迷宫，不同的蛋白质走不同的路，咱就能把它们给分开咯。
超滤技术也很厉害呢！它就像个超级筛子，能把小分子筛掉，留下咱要的蛋白质大分子。
沉淀技术呢，就像是下一场雪，把蛋白质给“冻”出来。
哎呀，你说这蛋白质分离纯化是不是很神奇？就这么一步步地，把那些小小的蛋白质给弄出来，还能让它们各归各位。
这要是没有这些技术，那好多研究和应用不就没法进行啦？咱得好好感谢那些研究这些技术的科学家们，是他们让我们能更好地了解蛋白质，利用蛋白质。
所以啊，蛋白质分离纯化可不是随便玩玩的，那是得认真对待，仔细研究的。
这每一步都不能马虎，每一个技术都有它的用处。
咱可得好好记住这些步骤和技术，说不定哪天咱自己也能动手试试呢！你说是不是？。
蛋白质纯化方案
蛋白质纯化方案
蛋白质纯化是一种常用的方法，用于从混合物中分离纯净的目标蛋
白质。
本文将介绍一种常见的蛋白质纯化方案，该方案包括以下几个
步骤：细胞裂解、固体沉淀、亲和层析和凝胶过滤。
1.细胞裂解
细胞裂解是蛋白质纯化的第一步，其目的是将目标蛋白质从细胞中
释放出来。
常用的方法有机械破碎、超声波破碎和化学解冻等。
选择
合适的细胞裂解方法要根据样品的特性和目标蛋白质的性质进行确定。
2.固体沉淀
在细胞裂解后，得到的混合物中包含大量的杂质，如细胞碎片、DNA和RNA等。
固体沉淀是将这些杂质与目标蛋白质分离的一种常
见方法。
通过离心，沉淀的杂质可以被分离出来，而上清液中含有较
高浓度的目标蛋白质。
3.亲和层析
亲和层析是一种高效的纯化方法，通过利用某些物质与目标蛋白质
之间的特异性相互作用来分离纯化目标蛋白质。
常用的亲和剂包括金
属离子、抗体、亲和基质和亲和标签等。
利用亲和剂与目标蛋白质结
合的特异性，可以将目标蛋白质从混合物中高效纯化出来。
4.凝胶过滤
凝胶过滤是一种基于分子大小的纯化方法。
通过使用一种具有特定孔径的凝胶材料，可以将目标蛋白质与其他较大分子分离开来。
这种方法常用于去除低分子量杂质和浓缩目标蛋白质。
总结：
蛋白质纯化方案是一个复杂的过程，需要根据样品特性和目标蛋白质的性质选择合适的方法。
细胞裂解、固体沉淀、亲和层析和凝胶过滤是常见的蛋白质纯化步骤。
正确选择和优化这些步骤可以高效地从混合物中纯化出目标蛋白质。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。
蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：一、根据分子大小不同分离纯化：蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
1、透析和渗滤：主要利用半透膜透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
2、离心离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。
3、凝胶过滤凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
二、根据溶解度不同分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取Protocol1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。
早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。
2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1,现配现用。
（1000ulRIPA+10ulPMSF）。
置入4℃冰上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。
一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。
b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块, 一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次（6〜8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000〜15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3〜5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3〜5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
C、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf管、离心管）。
12000r/min 4°C离心15min。
4、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。
可-80℃保存。
4、蛋白浓度测定。
a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1 （200ul：4ul）。
需测试复孔。
标本X，则需 A 量=2* （X+1+1）*200；B=2* （X+1+1）*4。
蛋白纯化的步骤
蛋白纯化的步骤嘿，咱今儿就来说说蛋白纯化这档子事儿哈！你想想看，蛋白就像是一群调皮的小孩子，在那乱糟糟的环境里跑来跑去，咱得想办法把咱想要的那个小家伙给揪出来，让它干干净净、清清爽爽的，这就是蛋白纯化啦！首先呢，得准备好材料和工具，这就好比要出门得先找好鞋子和包包一样重要。
咱得有合适的缓冲液，就像是给蛋白们准备的舒适小窝。
然后呢，就是细胞破碎这一步啦！这就像是打破一个大罐子，把里面的东西都给放出来。
把细胞弄破，让蛋白们从里面跑出来。
接着呢，就是离心啦！这就好像是把一堆东西放到一个大转盘上，转啊转，重的就沉下去了，轻的就浮在上面啦。
通过离心，把那些杂质啊啥的都给分离开。
然后呢，就是过滤啦！这就像给蛋白们过筛子，把那些大块头的杂质都给筛掉，留下咱们要的那些细细小小的蛋白。
再接下来就是关键的层析啦！这可就像是走迷宫一样，不同的蛋白会在这个迷宫里走不同的路，咱就可以根据它们的特点把它们给分开啦。
这里面又有好多不同的方法呢，什么离子交换层析啦，凝胶过滤层析啦，亲和层析啦，每种都有自己独特的用处。
离子交换层析呢，就像是蛋白们根据自己带的电荷来选择走哪条路，带正电的走这边，带负电的走那边。
凝胶过滤层析呢，就像是根据蛋白的大小来决定它们走的快慢，大的走得慢，小的走得快。
亲和层析就更厉害啦，就好像是蛋白们看到了自己最喜欢的东西，一下子就粘上去啦，其他的就被淘汰掉啦。
哎呀呀，你说这蛋白纯化是不是很有意思啊！把那些乱七八糟的蛋白一点点地给弄清楚，给分离开，就像是在玩一个超级有趣的游戏一样。
等咱把蛋白纯化好了，那可就像是得到了宝贝一样开心呢！可以用来做各种实验啦，研究啦，为科学做出贡献啦！这可不是一件简单的事儿哦，但只要咱认真去做，肯定能成功的。
所以啊，蛋白纯化虽然步骤不少，但只要咱有耐心，有细心，有决心，就一定能把那些调皮的蛋白小家伙们给收拾得服服帖帖的！你说是不是呀！。
(整理)蛋白纯化protocol
常见的实验注意事项●贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？可用0.1 N NaOH / 0.1%SDS 洗结块●Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？尽快用0.1 N HCl冲洗●Nandrop: 帐号李大伟老师(li d w) 密码： 62732710●自己的超声波：用大10头, 功率600W；用小3头, 功率不大于200W●如果pcr不成功,可能是pfu出了问题，也许是pfu没有活力（太多，太少或者buffer不对）●做酶切回收的质粒一定要用kit提●质粒连不上可能是胶回收问题，最好加异丙醇，终浓度可达50％●做SDS-PAGE的30％丙烯酰胺一定要过滤●蛋白质离心浓缩一定要用水平转子●蛋白质纯化一定用milli Q的水，最好每步都加1mM DTT●所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存●mono Q 结合蛋白质洗脱不下来, 可能都被mono Q吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题Mono Q洗柱子的方法: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol； 1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 饱和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 vol 每周都要洗一次Superpose 6洗柱子的方法: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol；1MNaCl 10 vol； 0.5M HCl, 饱和EDTA, 0.5% triton, 一些CTAB, 10 vol；1M NaCl 10 vol；0.0 M NaCl 10 volpH 8 调到用1M溶液调pH值pH6.0 1:4, 一般是1:10pet 15b 加上Met MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM 共21个氨基酸pet 32b 除去trx MHHHHHHSSGLGGENL YFQGS 共21个氨基酸300ml 10N NaOH 非精制胰蛋白胨/L370ml 10N NaOH 精制胰蛋白胨Trx: 14.6kDa pI 5.9Tev ： pI 8.5◆可溶于碱的污染物0.1 mol/L NaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。
蛋白质分离纯化步骤
蛋白质分离纯化步骤一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。
许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。
到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。
且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。
蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。
因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。
其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。
对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。
同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。
另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
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Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。
我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。
这些经验都是大家智慧的结晶。
同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。
一般像GE、Qia gen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5.在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？？？Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（NativeProtein）。
其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。
1.样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM 储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
该步骤冰上操作。
3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。
该步骤冰上操作。
4)加入10%Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。
5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。
加入DNase, 使DNase的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。
？？6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
附溶液配方：NTA-0 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,NTA-20 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole(咪唑)NTA-40 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole(咪唑)NTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM Imidazole(咪唑)NTA-80Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 80mM Imidazole(咪唑)NTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM Imidazole(咪唑)NTA-200Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 200mM Imidazole(咪唑)NTA-1000 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 1000mM Imidazole (咪唑)二变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。
这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。
与MBP和GST的亲和层析材料相比，NTA树脂可以在6M的盐酸胍存在的情况下与具有His Tag的蛋白质结合。
整个层析过程都是在有盐酸胍的条件下进行。
纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。
下列方法（步骤4-5）用于从细菌中抽提含His-Tag位于包涵体变性蛋白质。
1．样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol, 6M Guanidium HCl ）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。
3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。
4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
5)15000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。
2) 将样品（步骤2（5））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20，GuNTA-40，GuNTA-60，GuNTA-100，GuNTA-500洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
7)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。