第四章酶工程 酶的化学修饰_提纲_2016

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酶工程 第四章 酶分子修饰

酶工程 第四章 酶分子修饰
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4.5 酶的定向进化
� 酶分子的合理设计(rational design) � 酶分子的定向进化(directed evolution)
酶的合理设计
体外定向进化的意义
� 理论上,蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力,很多功能 有待于开发,这是酶的体外定向进化的基本先决条件。 � 所谓酶的体外定向进化,又称实验分子进化,属于蛋白 质的非合理设计,它不需事先了解酶的空间结构和催化 机制,通过人为地创造特殊的条件,模拟自然进化机制 (随机突变、重组和自然选择),在体外改造酶基因,并 定向选择出所需性质的突变酶。 � 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研 究和应用范围,特别是能够解决合理设计所不能解决的 问题,为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径,并且 正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
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4.3 酶分子的修饰方法
� 金属离子置换修饰, � 大分子结合修饰(共价/非共价) � 侧链基团修饰 � 肽链有限水解修饰 � 氨基酸置换修饰 � 酶分子的物理修饰
(1) 酶的金属离子置换修饰
� 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能 发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 � α-淀粉酶中的钙离子(Ca2+),谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+), 过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+),酰基氨基酸酶分子中的锌离子 (Zn2+),超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) � 若从酶分子中除去其所含的金属离子,酶往往会丧失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子,酶的催化活性可以恢复或者部分 恢复。若用另一种金属离子进行置换,则可使酶呈现出不同的特 性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失,有的却可以使酶的活力 提高或者增加酶的稳定性。

酶分子的化学修饰

酶分子的化学修饰
概念:利用水溶性大分子与酶结合,使酶的 空间结构发生精细的改变,从而改变酶的 特性与功能的方法。
作用: (1)提高酶活力 (2)增加酶的稳定性 (3)降低抗原抗体反应
资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式,可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
(1)大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求:
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性, 尽量少破坏必需基团,得到高的酶活力回 收。为此,有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
(一)酶分子的主链修饰 (二)酶分子的侧链基团修饰 (三)酶分子的化学交联修饰 (四)酶分子的大分子结合修饰 (五)酶分子的亲和标记修饰 (六)酶分子的基因修饰 (七)与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
(三)酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
概念:既可以酶分子内部亚基之间,也可 以在分子与分子之间。
资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
(二)酶分子的侧链基团修饰
概念:采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应,从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应,并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有:巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。

酶分子化学修饰

酶分子化学修饰
(heparin)、蔗糖聚合物(Ficoll)等。 修饰方法:修饰前活化,然后在一定条件下与酶
分子共价结合。
酶分子化学修饰
3. 应用: 如:PEG-超氧化物歧化酶(SOD)
PEG-溶血类蛋白质(链激酶、尿激酶等) PEG-天门冬酰胺酶(ASNase) • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如:用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶,-淀粉酶,胰 蛋白酶、过氧化氢酶,提高了酶的热稳定性。
酶分子化学修饰
根据氨基酸侧链R基的极性,20种氨基酸可分成4类。 ① 非极性R基氨基酸(共8种): 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)
应用实例: 1)提高酶活力: 2)消除抗原性:
酶分子化学修饰
(二)氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸,引起酶
蛋白空间构象的改变,从而改变酶的某些特性和功能的方 法。
通过两个途径实现: 化学修饰法:由于可用试剂的限制,获得的种类少。 蛋白质工程:利用基因操纵技术。 (三)金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子,使酶的特性和功能发 生改变的方法。
2,4-二硝基氟苯
碘乙酸
酶分子化学修饰
2) 羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。
可定量测定酶分子中羧基的数目。
+
水溶性碳化二亚胺
酶分子化学修饰

第四章__酶工程原理及其在食品工业中的应用详解

第四章__酶工程原理及其在食品工业中的应用详解

(2)离子吸附法。通过离子效应,将酶分子固定到 含有离子交换基团的固相载体上。 常见的载体:DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素、DOWEX-50等。 优点:操作简单,处理条件温和,能得到酶活回收 率较高的固定化酶。 缺点:酶与载体的结合力较弱,当离子强度高、缓 冲液种类或pH值发生变化时,酶容易脱落。
酶工程一般工艺流程示意图
胞外酶
胞内酶 菌种→基因改造→发酵→发酵酶液→预处理→细胞分离→细 胞破壁→碎片分离→提取→精制→酶制剂及其改造 酶制剂 ↓ 原料→前处理→杀菌→酶反应器→反应液→产品提取→成品
(二)酶工程的发展历程 1.20世纪50~60年代早期的酶工程技术,主要是从 动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种 酶制剂,并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 2.20世纪70年代后期,酶的固定化技术取得了突破, 使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等 酶工程技术迅速获得应用。 3.目前,各种酶工程技术已用于制造多种精细化工 产品和医药产品,并且在食品工业、化学检测和环境保 护等各个领域中得到了有效的应用。
(二)非机械破碎法 1.酶溶法 加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等,它们 对细胞壁或细胞膜进行酶解,使细胞破碎。 自溶法:在微生物生长代谢过程中,控制一定条件, 诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力, 以达到细胞自溶的目的。 2.化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属 螯合物等处理,使细胞壁或膜的通透性(渗透性)改变, 从而使胞内物质有选择地渗透出来。
(三)根据酶分子电荷性质的方法 1.离子交换层析 根据被分离物质与分离介质(离子交换剂)间异种电 荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂 上的可解离基团对各种离子的亲和力不同,而使不同物质 分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和 阴离子交换剂。酶具有两性性质,可用阳离子交换剂,也 可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。

酶工程酶分子侧链基团的化学修饰

酶工程酶分子侧链基团的化学修饰
酶工程酶分子侧链基团的化学修饰
一.特定氨基酸残基侧链基团的 化学修饰
• 酶分子中经常被修饰的氨基酸残基 侧链基团有:巯基,氨基,羧基, 咪唑基,酚基,胍基,吲哚基,硫 醚基及二硫键等。
1.巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性,采用巯基化学修饰 剂与酶蛋 白侧链上的巯基结合,使巯基发生改变,从而改变酶 的空间构象、特性和功能。
• ①烷基化试剂 烷基试剂中用得最多的是碘乙酸,碘乙酰胺, 巯基乙醇,谷胱甘肽(GSH)。
→ E—SH + ICH2COOH(或ICH2CONH2) E—S—CH2COOH(或E—
S—CH2CONH2)+HI ②汞试剂 这类试剂如HgCl2,对氯汞苯甲酸(p二酮
二羰基化合物 1,2-环己二酮
苯乙二醛
几种重要的修饰反应 1.烷基化反应
2.酰化及其相关反应
3.氧化和还原反应
4.芳香环取代反应
• 重要的修饰反应*
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应
• 特定氨基酸残基 侧链基团的化学 修饰*
巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
4.咪唑基的化学修饰
常用修饰剂:碘乙酸、 焦碳酸二乙酯等; 其中焦碳酸二乙酯在近 中性的条件下对组氨酸 残基上的咪唑基具有较 好的特异修饰能力,而 且产物在240 nm波长处 有最大吸收峰,可以通 过修饰得知分子中咪唑 基的数量。
5. 胍基的化学修饰
来源:Arg 修饰反应:本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂:
①乙酸酐修饰 ②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰. ③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger 反应) ④氨基的烷基化.这类试剂包括 卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等. ⑤丹磺酰氯(DNS)修饰. ⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即 Edman反应)

第四章 酶工程

第四章  酶工程
利用酶具有的特异催化功能,对酶结构进行修饰改 造,并借助于生物反应器和工艺优化过程,有效地发 挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括 酶的提取与分离纯化技术、酶固定化技术、酶非水相 催化技术、酶的蛋白质工程和酶反应器设计等。


化学酶工程
也称初级酶工程,指自然酶、化学修饰酶、固定 化酶以及人工合成酶的研究和应用。 (1)自然酶:由生物材料中分离出来的酶制成的 酶制剂。价格低,生产方式简单;应用方便,不需辅 因子参加;产品种类少,应用范围窄。 (2)化学修饰酶:通过酶分子的化学修饰达到改 性变构的目的。主要用于酶学研究和疾病治疗。

化学结合法
(1)共价结合法:将载体有关基团活化、与酶分 子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化 方法;与载体结合的酶功能团有α或ε-NH2,α、β 或γ-羧基,巯基,咪唑基,酚基等,但参与共价结 合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基团,否 则可能会导致固定后酶活力完全丧失;
( 2 )共价交联法 :通过双功能或多功能试剂 (交联剂),在酶分子之间或酶分子与微生物细胞 之间形成共价键的连接方法; 常用的交联剂有戊二 醛、异氰酸酯、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物等;

等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低,以及不同 的蛋白质具有不同的等电点这一特性,对酶进行分 离纯化的方法。经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀等 方法一起使用,使其沉淀完全。

有机溶剂沉淀法
利用酶在有机溶剂中溶解度不同而使其分离。 常用有机溶剂:乙醇、丙酮、异丙酮等。
(二)根据酶分子大小和形状不同的方法
酶反应器是完成酶促反应的装臵,研究内容包括 酶反应器的类型、特性;酶反应器的设计、制造及选 择等。
二、酶的生产与分离纯化技术

《酶工程》教学大纲

《酶工程》教学大纲

《酶工程》教学大纲课程编号:02202320 课程性质:必修课程名称:酶工程学时/ 学分:32/2英文名称:Enzyme Engineering考核方式:笔试选用教材:郭勇大纲执笔人:常雅宁先修课程:生物化学大纲审核人:张惠展适用专业:生物技术一.教学基本目标学生通过酶工程的学习,应熟悉从应用目的出发研究酶,在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线,掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用,进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势。

在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法,尤其是思想来指导自己的工作。

希望能激发学生爱专业的热情二.教学基本内容第一章绪论第一节酶工程的发展史和研究内容第二节国内外酶制剂工业概况第三节酶工程研究最新进展第二章酶与酶工程第一节酶的结构第二节酶的催化作用第三节酶作为催化剂的显著作用第四节酶催化的动力学第三章固定化酶与酶修饰第一节概述第二节固定化酶的性质及其影响因素第三节固定化酶和细胞的制备第四节固定化原生质体第五节固定化酶反应器第六节固定化酶的应用第七节固定化新技术与发展趋势第八节酶的修饰第四章酶的定向进化第一节酶的定向进化基础第二节酶的定向进化第三节蛋白质工程第四节酶的理性设计第五节酶分子的模拟计算第五章非水介质中的酶促反应第一节概述第二节有机介质中酶促反应的条件第三节有机介质对酶性质的影响第四节有机介质中酶促反应应用举例第五节非水介质的介绍第六章核酶和抗体酶第一节RNA核酶第二节D NA核酶第三节抗体酶第七章合成生物学、基因组学-酶与生物催化第一节人类基因组计划第二节高通量DNA序列分析技术第三节基因组学的研究进展第四节系统与合成生物学第五节生物大分子的合成与模块化第八章酶的人工模拟(选学)第一节模拟酶的理论基础和策略第二节模拟酶的分类第三节印迹酶第九章酶的工业化应用(选学)第一节酶制剂常用品种及其性能第二节酶制剂在淀粉糖工业中应用或在酿造工业中应用或在食品工业中的应用或在饲料工业中或洗涤剂工业或纺织造纸中或有机酸工业中应用第十章同工酶与气体酶学(选学)第一节同工酶的结构基础第二节同工酶的鉴别和测定第三节固氮酶的作用第四节甲烷加氧酶的作用第五节氧化CO的酶三、建议教学进度第一章2学时,第二章4学时第三章10学时第四章6学时第五章2学时,第六章4学时第七章2 学时前七章是基础版块必须学习。

4酶工程

4酶工程
• (一)细胞破碎
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第四章 酶 工 程
• (二)酶的提取
• 酶的提取是指在一定条件下,用适当的溶剂或溶液处理含 酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程,又称为酶 的抽提。
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第四章 酶 工 程
• (三)沉淀分离
• 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度 降低,从溶液中沉淀析出而与其他溶质分离的技术过程。
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第四章 酶 工 程
• 菌种活化与扩大培养工艺流程如下: • 菌种(原菌)→斜面试管→小三角瓶→大三角瓶
→卡氏罐→一级种子罐→二级种子罐
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第四章 酶 工 程
• (二)发酵方法
• 1. 温的最适生长
温度为28~32 ℃。 • 2. 通气和搅拌 • 在发酵过程中必须不断供给氧,一般通过供给无菌空气来
实现。 • 3. pH值的控制 • 细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5~8.0;霉菌和酵母的
生长最适pH值为4~6;植物细胞的生长最适pH值为5~6。
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第四章 酶 工 程
• (三)培养基
• 1. 碳源 • 2. 氮源 • 3. 无机盐 • 4. 生长因子 • 5. 产酶促进剂
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丰富,价格低廉,机械化程度高,经济效益高; • ③微生物菌株种类繁多,酶的品种齐全; • ④微生物具有较强的适应性和应变能力,可以通过适应、
诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。
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第四章 酶 工 程
• 一、产酶菌种的筛选
• (一)优良菌株的标准
• 一个优良的产酶菌种应具备以下几点:①繁殖快,产酶量 高,生产周期短;②适应性强,易培养和控制,便于管理 和降低生产成本;③产酶性能稳定,不易退化,不易受噬 菌体侵袭;④产生的酶容易分离纯化;⑤菌种本身和代谢 产物安全无毒,对生产人员、生产环境和酶的应用不会产 生不良影响。

酶分子修饰

酶分子修饰
第四章 酶分子修饰
第二节
酶分子的修饰方法
• 金属离子置换修饰
• 大分子结合修饰(共价/非共价)
• 侧链基团修饰
• 肽链有限水解修饰
• 氨基酸置换修饰 • 酶分子的物理修饰
1. 酶的金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使
酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离
子置换修饰。
• 但是化学修饰法难度大,成本高,专一性差, 而且要对酶分子逐个进行修饰,操作复杂,难 以工业化生产。
• 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技 术。 • 定点突变(site directed mutagenesis)是20世纪80 年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获 得突变基因的操作技术。是蛋白质工程(Protein Engineering)和酶分子组成单位置换修饰中常用 的技术。定点突变技术,为氨基酸或核苷酸的置 换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。
(1)对巯基的化学修饰:
常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 E-SH + ICHCOOH ----- E-S-CHCOOH + HI
(2)氨基的化学修饰: 常用的修饰试剂有乙酸酐、2,4,6-三硝基苯磺酸、2,4二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯 (PITC)等。
大分子修饰(共价)的过程
• 修饰剂的选择:大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如,聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物(Ficoll)、葡聚 糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
• 修饰剂的活化:作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子

酶的化学修饰

酶的化学修饰

七、酪氨酸残基的修饰
修饰酪氨酸残基 1)碘化反应:
I2+
+ HI
2)硝化: (NO2)4C+
+(NO2)3CH
八 小分子修饰
• 氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸 酐、乙酸—N—丁二酯亚胺酯等。
九.有机大分子对酶的化学修 饰
利用一些活性分子把特定的有机大分结 合到酶上,以改变酶的生理、生化性质 用于改变酶的稳定性、组织分布性、抗原 性及其它生化性质,在医药领域
在医药方面:
化学修饰可以提高医用酶的稳定性,延 长在体内半衰期,抑制免疫球蛋白的产生, 降低免疫原性和抗原性。
PEG修饰精氨酸酶
• 精氨酸酶具有抗癌作用,它用PEG修 饰后,与抗体结合能力和诱导产生新抗体 的能力均消失,在血液中停留时间延长, 显著地延长了移植肝癌后的小鼠生命。
PEG修饰尿酸酶
E-SH + R-S-S-R
E-S-S-R
+ R-SH
E-SH + E-S-S-R
E-S-S-E
+ R-SH
与—SH进行二硫键交换后,—SH被修饰,试剂 的另一半以单体放出。
常用的二硫键交换试剂: DTNB, 5, 5’-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate)
二硫二吡啶,4, 4’-dithiodipyridine (或2, 2’-dithiodipyridine)
四、巯基的化学修饰
• 5,5-二硫代-双(2-硝基苯甲酸) (DTMB,Ellman试剂)它与巯基反应形成二
硫键,释放出1个阴离子,412nm
• 有机汞试剂,修饰产物250nm • N-乙基马来酰亚胺300nm • 烷基化试剂
(4)修饰巯基

第四章酶分子修饰

第四章酶分子修饰

第四章酶分子修饰第四章酶分子改造教学目的:使学生了解酶分子改造的意义和酶分子改造的常用方法。

教学重点、难点:酶分子改造的常用方法,酶蛋白侧链基团修饰和氨基酸置换修饰。

教学方法:讲授教学手段:多媒体第一节酶分子修饰概述一、概述酶的广泛应用应用大规模应用酶和酶工艺的尚不够多酶自身缺点是最根本的原因不稳定,不适合大量生产需要工业应用中,常偏离酶最适pH临床上,外源蛋白质,具有抗原性改变酶特性的两种主要方法化学修饰基因工程技术(蛋白质工程)二、概念指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变,从而改变酶的特性和功能的过程创造出天然酶不具备的某些优良性状提高酶活力增加酶稳定性消除或降低酶的抗原性,扩大应用范围,提高经济效益三、酶分子修饰常用方法部分水解酶蛋白的非活性主链利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰酶辅因子的置换等基因工程、蛋白质工程(氨基酸置换)第二节金属离子置换修饰一、概念通过改变酶分子中所含的金属离子,使酶的特性和功能发生改变的方法,简称离子置换法二、原理金属离子往往是组成酶活性中心的部分,对酶的催化功能起重要作用金属离子的除去、加入与金属离子的置换活力改变、稳定性等改变只适用于本来就含有金属离子的酶?三、常用金属离子Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+、Co 2+、Cu 2+、Fe 2+四、操作酶纯化EDTA鳌合透析、超滤、分子筛除鳌合物加入不同金属离子确定实验结果五、例锌型蛋白→钙型蛋白,活力提高20%-30%杂离子型a-淀粉酶→钙离子型,活力提高并增加稳定性,结晶型活力比一般杂离子型结晶高3倍以上Fe-SOD→Mn-SOD,对H2O2稳定性增强,对NaN3敏感性显著降低Zn-酰基化氨基酸水解酶→Co型,最适pH从8.5降低到7.0,Km增大第三节大分子结合修饰一、概念利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空间结构发生某些精细的改变,从而改变酶的特性与功能的方法。

酶分子的修饰与应用课件

酶分子的修饰与应用课件

酶分子的修饰与应用
5
• 药用酶大多数来自各种动物、植物或微生物,当 其进入体内后,对于机体来说,酶是一种外源物 质,在它的刺激下,体内会运用某些机制对其进 行排斥。除了酶分子的结构特点以外,还由于酶 是生物大分子,所以有些酶蛋白具有抗原性。酶 蛋白的抗原性与其分子大小有关,大分子的酶蛋 白往往有较强的抗原性,而小分子的蛋白质或肽 段的抗原性较低或无抗原性。若采用适当的方法 使酶分子的肽链在特定的位点断裂,其分子质量 减少,就可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗 原性降低或消失,这种修饰方法又称为肽链有限 水解修饰。例如木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行 有限水解,除去其肽链的三分之二,该酶的活力 基本保持,其抗原性性却大大降低;又如,酵母 的烯醇化酶经肽链有限水解,除去由150个氨基酸 残基组成的肽段后,酶活力仍然可以保持,抗原 性却显著降低。
酶分子的修饰与应用
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• 可以与酶分子结合的大分子有水溶性和 水不溶性两类。采用不溶于水的大分子 与酶结合制成固定化酶后,其稳定性显 著提高(参看本书第五章)。采用水溶性的 大分子与酶共价结合进行酶分子修饰, 可以在酶分子外围形成保护层,起到保 护酶的空间构象的作用,从而增加酶的 稳定性。
酶分子的修饰与应用
21
• 现以SOD为例说明如下。
• SOD(EC1.15.1.1)催化超氧负离子 (O2-)进行氧化还原反应,生成氧和过 氧化氢。具有抗氧化、抗辐射、抗衰老 的功效,但是其在血浆中的半衰期仅为 6~30min,经过大分子修饰,其稳定性 显著提高,半衰期延长70~350倍,见下 表。
酶分子的修饰与应用
核酸类酶的稳定性较高,具有良好的开发 应用前景。
酶分子的修饰与应用
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• 阅读:P128-131 了解几种侧链修饰
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4.3.1 几种重要的修饰反应 (1) 酰基化反应
(2)烷基化反应
(3)氧化和还原反应
(4)芳香环取代反应 4.3.2 酶分子侧链基团的化学修饰举例 1、巯基的化学修饰
4
2、咪唑基的化学修饰
5
3、酚羟基的化学修饰
4、胍基的化学修饰
6
5、色氨酸吲哚基的化学修饰 6、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰
7
聚乙二醇: 聚乙二醇是一个线性分子,有良好的生物相容性,在体内不残留,无 毒,无抗原性,是一种优良修饰剂。 活化方法:三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法 三氯均嗪法是一个常用的方法。 三氯均嗪上氯原子很活泼,易发生亲核取代
右旋糖酐: 右旋糖酐是由 α-葡萄糖经 α-1, 6 糖苷键形成的多糖,有较好的水溶性及 生物相容性,可用作代血浆。 右旋糖酐链上的相邻双羟基结构经活化后可与酶上的自由氨基相结合。 溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下 活化,然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应,共价结合。 技术要点:
1
造。
化学修饰过程中需考虑的因素 ¾ 对酶性质的了解:活性部位,稳定条件,侧链基团性质,酶反应最适条 件等; ¾ 对修饰剂的要求:分子量,水溶性,活性基团,活化方式,活化条件, 修饰后酶活性的半衰期; ¾ 对反应条件的选择:分子比例,反应条件(反应温度、pH、时间、溶剂 性质、离子强度等)
4.2.2 化学修饰的方法学 1、 修饰反应专一性的控制 (1)试剂的选择:修饰目的;反应生成物容易定量测定;试剂大小
研究酶分子的解离-缔合现象 推算出酶分子大小、形态及构象变化 测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态
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利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离 2、确定氨基酸残基的功能 e.g. 在丙酮酸激酶的精氨酸残基的修饰反应过程中,伴随着精氨酸残基的修 饰,酶分子可逆地失活,底物保护作用说明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的 磷酸结合位点具有一个必需的精氨酸残基 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量
选择蛋白质修饰剂需考虑的问题 修饰反应要完成到什么程度 对个别氨基酸残基是否专一 在反应条件下,修饰反应有没有限度 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变 是否需要分离修饰后的衍生物 反应是否可逆 是否适合于建立快速、方便的分析方法
修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备的特征 选择性地与一个氨基酸残基反应 反应在酶蛋白不变性的条件下进行 标记的残基在肽中稳定,很容易通过降解分离出来,进行 鉴定 反应的程度能用简单的技术测定
第四章 酶的化学修饰
4.1 概述 酶分子修饰和改造的原因 稳定性不够,不能适应大量生产的需要 作用的最适条件不符 酶的主要动力学性质的不适应 临床应用的特殊要求 酶修饰的方向 核酸水平 蛋白质水平(化学修饰) 酶分子修饰和改造的概念与目的 概念:采用化学或分子生物学方法,通过主链的切割、剪接和侧 链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造,以改变其理化性质及生物活 性。 目的:人工改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些 优良特性甚至创造出新特性,扩大酶的应用领域。 酶分子修饰和改造的方向 对酶分子的侧链基团进行化学修饰 过酶分子与大分子结合的修饰 对酶分子内或分子间进行交联 用化学方法合成具有催化活性的酶,如模拟酶 用分子生物学技术对 DNA 或 RNA 进行分子改造,以获得化学结构 更为合理的酶蛋白。 克隆酶或修饰基因以便产生新的酶 设计新基因合成自然界不存在的新酶 体外分子定向进化:在体外模拟自然进化过程(随机突 变、重组和选择),使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质 或功能的新酶。
4.7 酶化学修饰的应用 理论研究:
酶中特定基团之间距离、氨基酸残基的存在状态、酶的大小、形状和构象、 确定酶活性部位、测定某种氨基酸数量 生物技术领域:
改变酶的最适 pH、改变酶底物专一性、提高酶耐热、酸、碱和有机溶剂的能 力 医药:
解除或降低医用酶免疫原性和抗原性、提高医用酶稳定性、延长医用酶体内 半衰期 4.7.1 化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 1、研究酶的空间结构
活性酯法- a.白蛋白琥珀酰化
活性酯法- b. 活性酯形成反应
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活性酯法- c. 修饰酶反应
4.5.2 金属离子置换修饰 1、 概念 通过改变酶分子中所含的金属离子,使酶的特性和功能发生改变的方法 称为金属离子置换修饰。 只适用于本来在结构中含有金属离子的酶 e.g. α-淀粉酶中的 Ca2+,谷氨酸脱氢酶中的 Zn2+,过氧化氢酶分子中的
(2)反应条件的选择 要求 不造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质 反应条件需考虑的因素 反应温度 pH 反应介质和缓冲液组成
(3)反应的专一性 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 e.g. 二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨
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酸作用,却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合 物作用 选择不同的反应 pH 利用某些产物的不稳定性 亲和标记 e.g. 对甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白的活性丝氨酸上 差别标记 利用蛋白质状态的差异 e.g. 在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液状态下提 高3倍 2、 修饰程度和修饰部位的测定 光谱法 间接法:同位素标记量;有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、荧光 标记量、修饰剂的可逆去除 3、 化学修饰结果的解释 蛋白质功能改变的解释 如果修饰发生在活性部位或必需基团上,则蛋白质活性的丧失与修饰 程度一定呈某种化学计量关系 当采用可逆保护试剂时,修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢 复活力,而且活力恢复程度应与保护基去除量呈一定比例关系 残基的不稳定性 原始修饰以后,还可能发生共价改变。 没有被发现的修饰 咪唑基、巯基、羧基甚至苯酚的酰化产物在反应条件下不稳定,或在 以后的纯化中被水解,因而检测不出。 有些修饰反应不能检测出来,只是由于它们在蛋白质化学中不占优势 地位,如:色氨酸 4.2.3 酶化学修饰采用的方法 定点突变:利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基,再 对突变的氨基酸残基进行化学修饰,引入一个小分子化合物。例如:改进的枯草 杆菌蛋白酶。 交联技术:使用双功能试剂如戊二醛、PEG 等将酶蛋白分子之间、亚基之 间或分子内不同肽链部分,进行共价交联。 小分子化合物:利用小分子化合物(邻苯二酸酐、氨基葡萄糖、醋酸酐、 硬脂酸等)对酶活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰。 单功能聚合物:单功能试剂的化学修饰可以使酶结合成具有特异功能的单 位或聚合体。最常用的化学修饰剂:聚乙二醇(PEG)及其衍生物。 4.3 酶分子侧链基团的化学修饰
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原因: ¾ 组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键,破坏了抗原决定簇的结 构 ¾ 大分子修饰剂遮盖抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应
4.6.3 体内半衰期 体内半衰期延长
4.6.4 最适 pH 有些酶经过化学修饰后,最适 pH 发生变化 例如:猪肝尿激酶的最适 pH 为 10.5,在 pH7.4 生理环境时仅剩余 5%-10%的
对组织的分布能力有所改变,能在血液中被靶器官选择性地吸收。 α-葡萄糖苷酶利用白蛋白修饰后,肝溶酶体摄入量达 35%,吞噬 细胞仅为 3% 辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后,穿透细胞的能力从 0.2%增强 到 15.9% 天然溶菌酶用唾液酸糖肽修饰后,每分钟肝摄入量从 3.2%增加到 34%。
Fe2+,酰基氨基酸酰胺酶分子中的 Zn2+,超氧化物歧化酶分子中的 Cu2+、Zn2+ 2、常用离子 常用二价金属离子 e.g. 将锌型蛋白酶的 Zn2+除去,用 Ca2+置换成钙型蛋白酶,则酶活力可提
高 20-30%,其结晶酶的酶活力比锌型的结晶酶可提高 2-3 倍。 3、金属离子置换修饰的过程 a.酶的分离纯化:首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得
4.7.3 蛋白质化学修饰的局限性 化学修饰专一性是相对的 酶的构象有些变化 只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行 研究酶结构与功能缺乏准确性和系统性
本章小结: 掌握酶化学修饰的原理、方法及对修饰剂的要求 了解酶分子侧链基团的常用化学修饰方法 了解有机大分子及蛋白质类对酶的修饰方法 掌握修饰酶的性质及特点 了解酶化学修饰的应用概况
4.6 修饰酶的性质及特点
4.6.1 热稳定性 热稳定性和耐蛋白水解酶增加
¾ 修饰剂与酶多点交联,增强了酶的结构刚性。 ¾ 减少了酶分子内部基团的热振动,固定了酶分子的构象。 例:每分子核糖核酸酶与 6.5 分子的右旋糖酐结合,可使该酶的活力提高到
原有酶活力的 2.25 倍。 4.6.2 抗原性 部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。
4.5 蛋白质类及其它 4.5.1 蛋白质类修饰
血浆蛋白质:被认为是具有较大优越性和前途的一类修饰剂,其中人血 清白蛋白应用较多。
常用方法: 1、戊二醛法:戊二醛双功能基团 2、碳二亚胺法:碳二亚胺作为交联剂 3、活性酯法: (1)原理:根据多肽合成原理发展起来 (2)特点:反应条件温和,避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触可能引起 酶失活,减少了副反应的产生,提高了修饰酶的活性回收率 。 (3)工艺步骤:
酶活 ,但用白蛋白修饰后,可保留 60%的酶活。 吲哚-3-链烷羟化酶修饰后,最适 pH 从 3.5 变到 5.5,在 pH 为 7 时,修饰酶
活性比天然酶增加 3 倍。 4.6.5 酶学性质的改变 绝大多数酶经过修饰后,最大反应速度没有改变,但有些酶在修饰后,米氏
常数会增大。 4.6.6 对组织的分布能力变化
具有一定纯度的酶液。 b.除去原有的金属离子:在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂,
如乙二胺四乙酸(EDTA)等,使酶分子中的金属离子与 EDTA 等形成螯合 物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法,将 EDTA-金属螯合物从酶液中除 去。此时,酶往往成为无活性状态。
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