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非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
莲草直胸跳甲短神经肽F受体基因sNPFR的克隆及表达分析
山西农业科学 2024，52（1）：137-144Journal of Shanxi Agricultural Sciences 莲草直胸跳甲短神经肽F受体基因sNPFR的克隆及表达分析王康，赵雪莹，霍楠，胡军，王苑馨，杨军，贾栋（山西农业大学植物保护学院，山西太谷 030801）摘要：为明确莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）短神经肽F受体AhsNPFR功能及其表达特点，为探索莲草直胸跳甲生防作用奠定理论基础，利用PCR技术克隆鉴定莲草直胸跳甲AhsNPFR基因并进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR技术分析其在莲草直胸跳甲不同发育时期和组织中的时空表达谱。
结果表明，克隆获得基因AhsNPFR全长1 669 bp，开放阅读框1 257 bp，编码418个氨基酸；预测其蛋白质分子质量为48.11 ku，理论等电点为8.21，AhsNPFR具有7个典型保守跨膜结构域，属于GPCRs家族，系统进化树分析表明，其与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera sNPFR亲缘关系最近。
AhsNPFR基因在不同发育阶段均有表达，在1龄幼虫中的表达量最高，是卵中表达量的9.06倍；在卵中表达量最低；雌成虫的表达量显著高于雄成虫。
AhsN⁃PFR基因在不同组织中均有表达，在3龄幼虫后肠中显著高表达，是脂肪体表达量的12.21倍；在雌雄成虫后肠显著高表达，并在所有组织中均没有雌雄表达差异。
关键词：莲草直胸跳甲；短神经肽F受体基因sNPFR；基因克隆；发育时期表达；组织表达中图分类号：S476.2 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2024）01‒0137‒08Cloning and Expression Profiling of Short Neuropeptide F ReceptorGene sNPFR in Agasicles hygrophilaWANG Kang，ZHAO Xueying，HUO Nan，HU Jun，WANG Yuanxin，YANG Jun，JIA Dong （College of Plant Protection，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）Abstract：To explore the function and expression characteristics of the short neuropeptide receptor AhsNPFR in Agasicles hygrophila, and to lay a theoretical foundation for exploring the biological control role of Agasicles hygrophila, in this study, the AhsNPFR gene was cloned using PCR technology and analyzed with bioinformatics software. The spatiotemporal expression profiles of AhsNPFR across different developmental stages and tissues were investigated by quantitative real-time PCR(qPCR). The results showed that the complete sequence of 1 669 bp was obtained, which was found to contain a 1 257 bp open reading frame(ORF), encoding 418 amino acids. The predicted molecular weight was 48.11 ku and the theoretical isoelectric point(pI) was 8.21. AhsNPFR had 7 typical conserved transmembrane domains and belonged to the GPCRs family. Phylogenetic tree analysis showed that AhsNPFR was closely related to Diabrotica virgifera virgifera sNPFR. AhsNPFR gene was expressed throughout the developmental stages tested with the highest expression levels at the first instar larva which was 9.06 times higher than those eggs, the stage with the lowest expression level. The expression level in female adult was significantly higher than that in male adult. The AhsNPFR gene was expressed in different tissues and was significantly highly expressed in the hindgut of the 3rd instar larvae, which was 12.21 times higher than those fat body. The AhsNPFR gene was significantly highly expressed in the hindgut of male and female adults, with no difference expression between the sexes across all tissues.Key words：Agasicles hygrophila; short neuropeptide F receptor gene sNPFR; gene cloning; developmental stage expres⁃sion; tissue expression神经肽是一类重要的信号分子，在昆虫的生长发育、繁殖和行为等多种生物学过程中发挥重要调节作用[1]。
基于重组EP153R蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法的建立
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报基于重组EP153R 蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA 方法的建立摘 要：为探究非洲猪瘟病毒（ASFV ）EP153R 蛋白的功能和建立ASFV 抗体间接ELISA 方法，本试验构建了EP153R 蛋白杆状病毒表达系统，采用Western blot 与IFA 鉴定rEP153R 蛋白的表达和免疫原性。
结果显示，杆状病毒能高效表达rEP153R 蛋白且可被小鼠多克隆抗体识别，具有良好的免疫原性。
以此重组蛋白为抗原进行间接ELISA 方法的建立，经方阵ELISA 确定当抗原包被量2.5 μg/mL ，ASFV 阳性血清稀释比1∶1000时为最佳反应条件；以优化后的条件确定了抗体阳性临界值为0.259；特异性试验结果表明，该方法仅与ASFV 阳性血清发生反应，具有较强的特异性；重复性试验结果显示变异率小于10%，重复性良好。
利用该方法对46份猪血清进行检测，与商品化试剂盒检测结果对比显示，符合率为91.3%，能较好的区分ASFV 阴性血清与阳性血清。
本研究的结果为后续EP153R 功能研究和ASFV 临床血清学诊断奠定了基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；杆状病毒；EP153R ；ELISA 中图分类号： S852.651文献标志码：A文章编号：1674-6422（2022）02-0074-10Development of Indirect ELISA for Detection of African Swine Fever VirusAntibodies Based on Recombinant EP153R ProteinCHENG Jia 1, LI Yao 1,2,3, LIU Yingnan 2,3, ZHONG Qiuping 2,3, SHI Xinjin 2,3, WEI Changqing 2,3,XIE Zhenhua 2,3, LIAO Xinxin 2, SONG Yingying 2,3, CHEN Hongjun 2,3(1. College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030801, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Biosafety Research Center, CASS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-12-20基金项目：国家自然科学基金面上项目（32170161）；国家自然基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：程佳，女，副教授，主要从事兽医药理学及毒理学研究；李遥，男硕士研究生，E-mail：*****************通信作者：程佳，E-mail：********************；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: To explore the function of African swine fever virus (ASFV) EP153R protein and develop an indirect ELISA for detecting antibodies against ASFV , the recombinant EP153R was produced using the baculovirus expression system. The immunogenicity of the recombinant rEP153R protein was determined in Western blot and IFA. The results showed that the recombinant EP153R protein was expressed in baculovirus and recognized by mouse polyclonal antibodies. Subsequently, an indirect ELISA method was developed and optimized using the recombinant EP153R protein at 2.5 μg/mL and positive ASFV serum at 1:1000 dilution. The cutoff value for positive antiserum was determined to be 0.259. This indirect ELISA method reacted with ASFV positive serum samples only, indicating its good2022,30(2): 74-83程 佳1，李 遥1,2,3，刘英楠2,3，钟秋萍2,3，史馨瑾2,3，魏常青2,3，谢振华2,3，廖欣欣2，宋影影2,3，陈鸿军2,3（1.山西农业大学动物医学学院，山西030801；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；3.中国农业科学院生物安全研究中心，上海200241）· 75 ·程 佳等：基于重组EP153R 蛋白的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA 方法的建立第30卷第2期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染野猪和家猪引起的一种烈性传染病，发病猪特征病变为全身性淋巴结出血、坏死，尤其是内脏淋巴结病变最为明显，病猪脾脏充血、肿大，强毒株致死率接近100%[1]。
支原体检测说明书
SaveIt系列产品——支原体检测试剂盒说明书一、产品简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST快速支原体检测试剂盒。
本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。
汉恒生物（）推出的SaveIt TM抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。
二、产品包装产品规格见标签三、使用说明使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。
四、操作步骤4.1样品处理1、A：培养贴壁细胞：不须胰酶消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。
B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2、细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
3、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
4、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、4℃ 12,000g离心15min。
6、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min 。
病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(12): 2371 2378 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.01094病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用胡蕊洁杨向芸贾磊李玉如项月岳洁瑜王华忠*天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387摘要: 自噬相关因子ATG8定位于自噬结构的膜上, 荧光蛋白标记的ATG8在过表达细胞内所呈现的点状荧光常用于表征自噬结构和监测自噬活性。
病毒介导的过表达(virus-mediated over-expression, VOX)是一种简便、快速制备目的基因过表达植株的技术。
采用基于狗尾草花叶病毒FoMV的VOX技术(FoMV-VOX)在小麦植株中表达GFP标记的小麦ATG8家族成员TaATG8a, 建立小麦活体植株的自噬活性监测技术平台。
构建了融合基因GFP-TaATG8a的FoMV-VOX载体, 采用Agroinfiltration方法在本氏烟草叶片中表达携带GFP-TaATG8a的FoMV基因组RNA和组装病毒粒子, 将烟草汁液中的病毒粒子摩擦接种于小麦幼苗植株叶片, 对接种植株叶片和根组织中的荧光信号进行观察和特征鉴定。
结果表明, 采用FoMV-VOX技术在小麦植株上不仅可以实现GFP-TaATG8a在接种叶片中的高效表达, 还可以借助病毒的系统侵染实现该融合基因在未接种叶片和根组织中的高效表达。
经饥饿处理激活自噬, 融合蛋白GFP-TaATG8a在植株叶表皮、叶肉以及根细胞中呈现表征自噬结构的点状荧光。
采用FoMV-VOX技术获得的GFP-TaATG8a过表达植株可以应用于小麦多种组织类型中的自噬活性调节机制和生理功能研究。
关键词:小麦; 病毒介导的过表达; ATG8; 细胞自噬Virus-mediated expression of GFP-ATG8 for autophagy monitoring in wheatHU Rui-Jie, YANG Xiang-Yun, JIA Lei, LI Yu-Ru, XIANG Yue, YUE Jie-Yu, and WANG Hua-Zhong*School of Life Sciences, Tianjin Normal University / Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, ChinaAbstract: ATG8 is an essential autophagy-related factor decorating on the membranes of autophagic structures. Fluorescenceprotein-tagged A TG8 expressed in live cells has been widely used to visualize autophagic structures and to monitor the activity ofautophagy. Virus-mediated over-expression (VOX) is a simple technique for rapid expression of genes of interest in plants. Herethe foxtail mosaic virus (FoMV)-based VOX was adopted for preparation of wheat seedlings over-expressing the GFP-taggedform of the wheat ATG8 family member TaATG8a. An FoMV-VOX vector was constructed for expression of the recombinantFoMV genomic RNA carrying the GFP-TaATG8a sequence. Expression of FoMV genomic RNA and assembly of FoMV virionswere accomplished in Nicotiana benthamiana leaves through agroinfiltration. N. benthamiana leave extract containing FoMVvirions was used to inoculate leaves of wheat seedlings. Fluorescence microscopy of virus-inoculated wheat seedlings showed theefficient expression of GFP-TaATG8a was in not only inoculated leaves but also systemic uninoculated leaves and roots. More-over, punctate fluorescence of GFP-TaATG8a representing autophagic structures was clearly observed in leaf epidermal cells,mesophyll cells, and root cells of wheat seedlings subjected to autophagy-stimulating starvation stress. The autophagy activity inthese cells could be evaluated by quantifying the GFP-TaATG8a-labeled autophagic structures. These results lay a foundation forstudies of the regulating mechanisms and physiological roles of autophagy in various wheat tissues.Keywords: wheat (Triticum aesticum L.); virus-mediated over-expression (VOX); ATG8; autophagy细胞自噬(autophagy, 简称自噬)与植物生长、发育、衰老、细胞死亡和逆境响应等过程密切相关[1-3]。
基因扩增简介
目的基因扩增SOP聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
这也是“微量证据”的威力之所在。
由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。
到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。
1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
一、PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
分枝杆菌利福平耐药基因rpoB_高通量突变文库的构建
第 44卷第4期2023 年7月Vol.44 No.4July 2023中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）分枝杆菌利福平耐药基因rpoB高通量突变文库的构建陈勇1，冯思源2，徐霖2，田国宝2（1. 成都医学院医学检验系，四川成都 610500； 2. 中山大学中山医学院免疫学与微生物学系，广东广州 510080）摘要：【目的】 建立利福平耐药基因rpoB高通量突变文库。
【方法】 通过同源重组和L5 attB噬菌体整合位点交换构建耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB：：rpoB菌株；基于L5 attB质粒交换系统和抗性选择培养基，挑取48个克隆以验证质粒替换的效率；针对利福平耐药决定区（RRDR）区域内以每３个碱基为单位设计简并性引物，通过PCR扩增获得该区域81个碱基的全覆盖式突变文库；文库片段与载体进行无缝克隆转化到大肠杆菌中形成大肠杆菌突变文库；基于质粒交换原理，将突变质粒库转化至耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB：：rpoB菌株中，替换原有L5 attB位点质粒，形成耻垢分枝杆菌突变文库；通过基因组提取、建库和高通量测序明确文库的基因型种类。
【结果】 与野生型rpoB基因（5 600 bp）相比，敲除株的扩增片段为2 200 bp，证明耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB：：rpoB条件性敲除株构建成功；质粒替换的成功率为100%；大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库中单氨基酸突变类型均为540种，大肠杆菌文库多点突变5 301种，耻垢分枝杆菌文库多点突变853种，大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库相关系数为0.84。
【结论】 开发了一种针对分枝杆菌必需基因rpoB突变体文库的构建策略，成功建立了利福平耐药基因rpoB的突变文库。
关键词：分枝杆菌；利福平耐药；突变文库；rpoB中图分类号：R378 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2023）04-0634-08DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.2023.0413Construction of a High-Throughput Mutation Library of MycobacteriumRifampin Resistance Gene rpoBCHEN Yong1， FENG Si-yuan2， XU lin2， TIAN Guo-bao2（1. School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China； 2. Department of Microbiology and Immunology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China）Correspondence to： TIAN Guo-bao； E-mail：****************Abstract：【Objective】 To establish a mutation library of rifampicin resistance gene rpoB.【Methods】 The ΔrpoB attB：：rpoB strain of Mycobacterium smegmatis（M. smegmatis） be constructed by homologous recombination and L5 attB phage integration site exchange. Based on the L5 attB plasmid exchange system and resistance selection medium， 48 clones are selected to verify plasmid replacement efficiency. Degenerate primers are designed every 3 bases in the rifampicin resis⁃tance determining region （RRDR）， and a full-coverage mutation library of 81 bases in RRDR region is obtained by PCR amplification. The library fragments are seamlessly cloned into the vector and transformed into Escherichia coli（E. coli）to form an E. coli mutation library. Based on the principle of plasmid exchange， the mutant plasmid library is transformed into the M. smegmatis strain ΔrpoB attB：：rpoB， and the original L5 attB site plasmid is replaced to form the M. smegmatis mu⁃tant library. The genotype of the library are determined by genome extraction， library construction and high-throughput se⁃quencing.【Results】Compared with the wild-type rpoB gene （5 600 bp），the amplified fragment of the rpoB knockout strain is 2 200 bp， which proved that the ΔrpoB attB：：rpoB conditional knockout strain of M. smegmatis is successfully constructed. The success rate of plasmid replacement is 100%. There were 540 kinds of single amino acid mutations in bothE. coli library and M. smegmatis library， 5 301 kinds of multi-point mutations in E. coli library， and 853 kinds of multi-·基础研究·收稿日期：2023-03-17基金项目：国家自然科学基金（81830103，82061128001）作者简介：陈勇，研究方向：临床细菌耐药与感染，E-mail：***********************；田国宝，通信作者，博士，教授，研究方向：临床细菌耐药与感染，E-mail：****************第4期陈勇，等.分枝杆菌利福平耐药基因rpoB高通量突变文库的构建point mutations in M. smegmatis library. The correlation coefficient between E. coli library and M. smegmatis library is 0.84.【Conclusions】 We have developed a strategy to construct a library of mutants targeting the essential mycobacterial gene rpoB， and successfully established a mutant library of rifampicin resistance gene rpoB.Key words：mycobacterium； rifampicin resistance； library of mutations；rpoB［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2023，44（4）：634-641］结核病是造成人类死亡的重要原因之一。
传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价
传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价作者：马景霞王常伟吴洪才何吉鑫牛晓赛段志强朱杰来源：《南方农业学报》2023年第06期DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.029摘要：【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株（vaIBDV）VP2蛋白原核表达质粒，并明确VP2蛋白的免疫原性，为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。
【方法】从IBDV新型变异株（BZ）中扩增VP2基因片段，亚克隆至pET-28a（+）载体上构建重组原核表达质粒，并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE 和Western blotting进行鉴定，并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定；经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后，制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡，通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。
【结果】在25 ℃下以IPTG进行诱导表达，获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表達，大小约40 kD，且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应，其琼扩效价可达1∶32；经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后，融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。
以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好，安全性高，无免疫引起的不良反应，剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。
免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8，而血清抗体效价均在1∶20000以上，表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应，抗体阳性率达100%；使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况，结果显示免疫组鸡只均未发病，其法氏囊也无明显萎缩现象，即免疫保护率达100%。
【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达，且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好，能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果，为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。
Phanta超高保真酶
f. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase在0.5～2 U/50 μl反应之间进行优化。 但请勿超过2 U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。 * PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
组分 ddH2O 5 × SF Buffer (with 10 mM MgSO4) dNTP Mix (10 mM each) 引物1 (10 μM) 引物2 (10 μM) 模板DNA DMSO 5 × PCR Enhancer PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μl)
模板种类/扩增长度 基因组DNA 质粒或病毒DNA cDNA
< 1 kb
1 kb ～ 10 kb
50 ng ～ 250 ng 100 ng ～ 300 ng
10 pg ～ 20 ng 10 pg ～ 20 ng
1–5 μl (不超过PCR反应总体积的1/10)
>10 kb 150 ng ～ 400 ng 1 ng ～ 30 ng
DMSOc
5 × PCR Enhancerd
模板DNAe
引物1 (10 μM)
引物2 (10 μM)
PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μl)f
to 50 μl 10 μl optional 1 μl optional optional optional 2 μl 2 μl 1 μl
定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活
定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活周海岩;李会帅;王培;柳志强【摘要】为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h 的P4H进行三维结构模拟和\"热点\"氨基酸分析,选择了7个位于\"疏水口袋\"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K.采用F137R和Y205K催化转化0.35 g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09 mg/L和52.29 mg/L),比野生型酶分别提高了58％和50％.经过分子对接比较发现,突变型P4 H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的.该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2018(047)004【总页数】6页(P193-198)【关键词】L-脯氨酸4-羟化酶;反式-4-羟基-L-脯氨酸;生物催化;定点饱和突变【作者】周海岩;李会帅;王培;柳志强【作者单位】浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州 310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州 310014【正文语种】中文【中图分类】Q814.9反式－4－羟基－L－脯氨酸（4－Hyp）是一种应用广泛的高附加值非天然氨基酸［1］。
红蓝光诱导下红地球葡萄VvBES1-1_基因表达模式分析
核农学报2024，38（4）：0622~0632Journal of Nuclear Agricultural Sciences红蓝光诱导下红地球葡萄VvBES1-1基因表达模式分析党仕卓1周娟2汤学燊1刘鑫1张亚红1， *袁苗1（1宁夏大学葡萄酒与园艺学院，宁夏银川750021；2宁夏大学林草学院，宁夏银川750021）摘要：BRI1-EMS-Suppressor 1（BES1）是油菜素内酯信号转导重要的转录因子，已被证实在调控植物光形态建成及花芽发育方面发挥重要作用。
为探究VvBES1是否响应红蓝光调控红地球葡萄花芽分化及在该调控模式下VvBES1的表达规律，本研究以红地球葡萄花芽为试验材料，温室自然光作为对照（CK），红蓝4∶1（R4B1）为光照处理，从前期转录组数据筛选获得VvBES1-1（Vitvi10g00636），同源克隆获得该基因编码序列（CDS），全长1 026 bp，编码341个氨基酸；生物信息学分析结果显示，VvBES1-1蛋白含有1个BES1家族高度保守的BES1-N结合结构域，与河岸葡萄属于同一亚族。
VvBES1-1表达具有组织特异性，VvBES1-1时空表达模式显示，VvBES1-1在各时期均有一定表达，但是在R4B1处理期间表达量显著低于自然光，9月15日（花序二级轴发育期）表达量达到最高，由此推测VvBES1-1在红地球葡萄花序二级轴发育期发挥重要作用。
VvBES1-1烟草异源转化试验结果显示，转基因植株表现出花期延迟、节间缩短等表型特征，外源BR处理下VvBES1-1基因表达量均明显上调表达，VvBES1-1在光介导控花芽分化的过程中表达模式呈先升后降趋势且同红地球葡萄中的一致。
本研究结果为VvBES1-1参与红蓝光介导BR信号调控红地球葡萄花芽分化提供了理论依据。
关键词：红地球葡萄；VvBES1-1； BR信号；表达特性DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2024.04.0622葡萄（Vitis vinifera）栽培面积广泛，经济效益高，是世界古老的果树，也是宁夏乃至西北地区设施果树的主栽树种。