酶联免疫吸附测定法elisa法

合集下载

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。

ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。

下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。

1.直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。

待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。

然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。

酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。

2.间接ELISA间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。

在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。

待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。

然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。

酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。

3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。

在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。

待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，形成复合物。

然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。

酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。

4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。

在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。

酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。

(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。

2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。

2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。

酶联免疫吸附测定法(elisa法)

加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体
加底物进行酶催化反应
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定
（二）间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
酶
辣根过氧化物酶
底物
邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反应
橘红色黄色棕色兰色蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷酶
黄色红色黄色深蓝色荧光黄色
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理

SOP_13-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与注意事项一、基本原理1、包被1.1、固相载体的要求（1）、结合抗体或抗原的容量大（2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面（3）、不影响免疫反应性（4）、利于反应充分进行（5）、固相方法简便易行，快速经济1.2、固相载体的材料：聚笨乙烯1.3、包被coating将抗原或抗体结合于固相载体。

1.4、封闭blocking用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。

2、反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。

标记酶的要求：(1)、活性高(2)、性质稳定(3)、专一性强(4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)、方法敏感，重复性好，简单易行(6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉常用酶辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶）3、洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。

4、底物显色HRPDH2+H2O2—————→D+2H2OH2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。

供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。

常用底物：四甲基联苯胺TMB四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。

TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。

二、常用方法与原理1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似双抗体夹心法应用：乙型肝炎表面抗体3、竞争法（测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。

加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）4、竞争法（测抗体）原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测5、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。

酶联免疫吸附实验 (ELISA)

酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。

用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

酶联免疫吸附法elisa

酶联免疫吸附法elisa
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测生物样本中特定分子（例如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。

ELISA技术基于免疫学原理，结合酶与底物的相互作用，通过测量酶的活性来间接或直接检测目标分子。

ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA 等不同类型。

直接ELISA是将待测样本直接加入包含特异性抗体的微孔板孔中，使目标分子与固相抗体形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。

最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

间接ELISA首先将待测样本加入包含特异性抗原的微孔板孔中，使目标分子与固相抗原形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。

最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

竞争ELISA是将已知浓度的抗原与待测样本中的抗原竞争结合到固相抗体上，然后添加酶标记的二抗，通过测量酶活性来判断待测样本中的抗原浓度。

夹心ELISA先将特异性抗体固定在微孔板孔上，待测样本中的抗原结合到固相抗体上，然后再加入酶标记的二抗，使其与抗原形成复合物，最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

ELISA技术广泛应用于医学、生物学、疫苗研发、食品安全等领
域，可以快速、准确地检测目标分子的存在和浓度，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

酶联免疫吸附测定法ELISA在抗生素残留检测中的应用

将ELISA技术应用于其他食品基质中抗生素残留的检测，扩大其应用范围。
加强国际合作与交流
加强与其他国家和地区的合作与交流，共同推进ELISA技术在抗生素残留检测领域的发展和应用。
07 参考文献
参考文献
1 2
参考文献1
介绍了ELISA的基本原理和在抗生素残留检测中的应用，强调了其高灵敏度和特异性。
抗生素残留的来源
畜牧业和农业中广泛使用抗生素，导致动物产品如肉类、蛋类和奶制品中存在抗生素残留。
ELISA技术简介
01
酶联免疫吸附测定法（ELISA）
是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过酶标记技术将免疫反应与
化学信号放大相结合，实现对目标物质的灵敏检测。
02
ELISA技术的优点
高灵敏度、特异性、操作简便、适合批量检测等。
03 ELISA在抗生素残留检测中的应用
抗生素残留检测的重要性
保障食品安全
抗生素残留超标可能对人体健康造成危害，如产生过敏反应、耐药性等，因此对抗生素残留进行检测是保障食品安全的重要环节。
国际贸易标准
随着国际贸易的发展，各国对抗生素残留的检测标准日益严格，符合国际标准的检测方法对于出口农产品的企业至关重要。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）在抗生素残留检测中的应用
目录
• 引言 • ELISA技术原理 • ELISA在抗生素残留检测中的应用 • ELISA技术的实验流程 • 实验结果和数据分析 • 结论 • 参考文献
01 引言
抗生素残留问题
抗生素残留对人类健康的潜在威胁
长期摄入含有抗生素残留的食物可能增加人体内耐药菌株的形成，降低抗生素在治疗疾病时的有效性。
03
ELISA技术的基本原理

细胞外基质降解的检测实验方法和marker

细胞外基质降解的检测实验方法和marker细胞外基质是由多种蛋白质、多糖和其他分子组成的复杂网络结构，对细胞的生存、生长和功能起着重要作用。

细胞外基质的降解与多种疾病的发生发展密切相关，因此对细胞外基质降解的检测具有重要的研究意义。

本文将介绍细胞外基质降解的检测实验方法和marker。

一、细胞外基质的降解实验方法1.酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA是一种常用的检测细胞外基质降解的方法，通过检测特定蛋白质在细胞外基质中的含量来评估基质的降解情况。

ELISA方法需先将不同时间、不同处理条件下的细胞外基质样品加入到特定的酶联试剂盒孔板中，加入特异性的抗体和酶标记抗体进行共同反应，测定细胞外基质中特定蛋白质的含量。

2.凝胶阻抗法（Gelatin zymography）凝胶阻抗法是一种检测细胞外基质降解的电泳技术，它能够通过酶降解凝胶中的凝胶蛋白胶原或明胶，从而分析细胞外基质中降解酶的活性。

实验时，样品混合物中含有细胞外基质降解酶以及其相应的底物，通过电泳使样品中的底物被降解酶水解，然后用染色荧光素化作为检测底物降解的效果。

3.荧光探针法荧光探针法是一种通过荧光信号来检测细胞外基质降解的方法。

通过在细胞外基质样品中加入特定的荧光标记的底物，当底物被降解酶降解时会释放出荧光信号，通过检测样品中的荧光强度来评估细胞外基质的降解情况。

以上三种方法是目前常用的细胞外基质降解的检测实验方法，它们分别采用酶联免疫吸附测定法、凝胶阻抗法和荧光探针法，具有高灵敏度、高特异性和较好的实验操作性。

二、细胞外基质降解的marker1.粘附蛋白（Adhesion molecules）粘附蛋白在细胞外基质中起着细胞粘附和迁移的重要作用，是细胞外基质降解的重要marker。

其在ELISA、凝胶阻抗和荧光探针实验中的变化可以反映细胞外基质的降解情况。

2.胶原（Collagen）胶原是细胞外基质中的重要成分，其降解与多种疾病如风湿性关节炎、肿瘤侵袭和转移等密切相关。

免疫因子检测方法

免疫因子检测方法免疫因子检测方法是一种用于检测免疫因子（如抗体、细胞因子、细胞表面标记物等）存在和活性的方法。

这些免疫因子在机体中起着重要的免疫监测和调节作用，因此其检测对于研究和诊断免疫相关疾病具有重要意义。

以下将介绍几种常见的免疫因子检测方法。

一、酶联免疫吸附测定法（ELISA）酶联免疫吸附测定法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、细胞因子等免疫因子的含量和活性。

它基于免疫反应原理，利用固相底物上的抗原或抗体与待测物特异性结合，并通过化学反应使结合物表现出可测量的信号。

ELISA方法操作简便，灵敏度高，可以同时检测多个样本，并可定量测定免疫因子的浓度。

二、流式细胞术流式细胞术是一种用于检测细胞表面标记物和细胞因子的免疫因子检测方法。

它基于细胞免疫荧光染色原理，通过给细胞标记上特定的荧光抗体，再通过流式细胞仪进行检测和定量分析。

流式细胞术具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，可以同时检测多个标记物，并通过细胞表面标记物的多参数分析来分辨不同细胞亚群。

三、免疫组化法（IHC）免疫组化法是一种常用的组织免疫因子检测方法，可用于检测组织内抗体、细胞因子等的存在和表达情况。

免疫组化法通过将待测物与特异性抗体结合，再通过染色反应可使抗体反应物表现出可见的颜色或荧光信号。

免疫组化法可以定位和定量分析免疫因子在组织中的分布、表达和定位，对于研究免疫相关疾病的病理机制具有重要意义。

四、免疫电泳法免疫电泳法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、抗原等的存在和相互作用。

它利用电泳原理，将待测物分离并定位在凝胶上；再通过将特异性抗体与待测物结合，并通过化学反应可呈现出可测量的信号。

免疫电泳法可以用于检测免疫复合物的形成以及免疫因子间相互作用的强弱关系。

总结起来，免疫因子检测方法包括酶联免疫吸附测定法、流式细胞术、免疫组化法和免疫电泳法等。

这些方法根据免疫原理和检测目标的不同，具有不同的优点和适用范围。

elisa法检测步骤

elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。

它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。

下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。

1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。

固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。

2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。

3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。

特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。

4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。

酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。

5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。

酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。

常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。

6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。

常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。

7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。

ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。

ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。

但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。

2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。

3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。

4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。

免疫球蛋白的检测方法

免疫球蛋白的检测方法免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig）是一类在机体免疫应答中起关键作用的蛋白质，它能够识别和结合抗原，参与免疫反应的调节和执行。

因此，对免疫球蛋白的检测具有重要的临床意义。

本文将介绍免疫球蛋白的检测方法，以及各种方法的优缺点和适用范围。

一、免疫球蛋白的定量检测方法。

1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

ELISA法是一种常用的免疫球蛋白定量检测方法，其原理是利用酶标记抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过底物的反应产生显色反应来定量测定免疫球蛋白的含量。

ELISA法操作简便，灵敏度高，且能够同时检测多个样本，因此被广泛应用于临床诊断和科研领域。

2. 免疫荧光法。

免疫荧光法是利用荧光标记的抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过荧光显微镜观察荧光信号来定量测定免疫球蛋白的含量。

该方法操作简单，对样本的要求较低，且具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测。

二、免疫球蛋白的定性检测方法。

1. 免疫固定电泳法。

免疫固定电泳法是一种通过电泳分离待测血清中的免疫球蛋白亚型的方法。

该方法操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，对于某些免疫球蛋白病的诊断具有重要意义。

2. 免疫印迹法（Western Blot）。

免疫印迹法是一种通过将待测血清中的免疫球蛋白分离并转移至膜上，再通过特异性抗体的结合来检测免疫球蛋白的方法。

该方法具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定。

三、各种方法的优缺点和适用范围。

1. ELISA法的优点是操作简便，灵敏度高，适用于大规模样本的检测，但其缺点是对待测物质的亲和性要求较高。

2. 免疫荧光法的优点是具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测，但其缺点是需要荧光显微镜等专门设备。

3. 免疫固定电泳法的优点是操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，但其缺点是不能进行定量测定。

4. 免疫印迹法的优点是具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定，但其缺点是操作较为繁琐，且耗时较长。

抗体亲和力检测方法

抗体亲和力检测方法
抗体亲和力检测方法有多种，以下是其中一些常见的：
1. ELISA法：酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,简称ELISA)是一种常用的抗体亲和力检测方法。

该方法利用特异性抗原与待测抗体之间的结合反应来测定抗体的亲和力。

在ELISA中，将待测抗体与已知浓度的抗原混合后加入微孔板中，然后用酶标记的二抗或底物进行反应，最后通过测量吸光度值来确定待测抗体的亲和力。

2. SPR法：表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,简称SPR)是一种基于光学原理的抗体亲和力检测方法。

该方法利用金属薄膜表面的等离子体共振现象来检测分子间的相互作用。

在SPR中，将待测抗体和已知浓度的抗原分别注入到两个不同的通道中，然后通过测量反射光强度的变化来确定待测抗体的亲和力。

3. Biacore法：Biacore是一种基于表面等离子共振技术的高通量筛选平台，可以同时检测多个样品中的抗体亲和力。

在Biacore中，将待测抗体和已知浓度的抗原分别注入到不同的通道中，然后通过测量反射光强度的变化来确定待测抗体的亲和力。

4. FRET法：荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,简称FRET)是一种基于荧光共振能量转移原理的抗体亲和力检测方法。

该方法利用荧光标记的抗原和待测抗体之间的相互作用来测定抗体的亲和力。

在FRET中，将待测抗体和已知浓度的抗原分别注入到两个不同的通道中，然后通过测量荧光信号的变化来确定待测抗体的亲和力。

ELISA方法及基本原理

ELISA方法及基本原理ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）即酶联免疫吸附测定法，是一种常用的免疫分析技术。

ELISA方法通过将特定抗原或抗体固定在试验板上，并利用酶标记二抗或酶标记抗原来检测目标分子的存在和浓度水平。

下面将详细介绍ELISA方法的原理和步骤。

间接ELISA方法是最常用的ELISA形式之一、它首先在试验板上固定抗原或抗体，然后经过样品孵育，样品中的目标分子与固定的抗原或抗体反应。

接着，加入一种与目标分子反应的酶标记二抗，引物二抗与样品中的目标分子结合。

最后，加入底物，底物经过酶的催化作用而产生可观测的颜色变化。

颜色的强度与目标分子的浓度呈正相关关系。

竞争ELISA方法是通过固定一个抗原或抗体于试验板上，然后将非标记的目标物质或样品加入到试验板孔中，与固定的抗原或抗体竞争结合。

接着，加入酶标记的抗体或抗原，使其与未结合的目标物质竞争结合。

孵育完成后，固定标记物分子的孔洞的底物测定，底物变色程度与未结合的标记物分子的多少呈反比关系。

夹心ELISA方法是通过在试验板上固定抗体，接着孵育样品，在第一次孵育结束后洗涤，然后孵育酶标记的第二抗体。

孵育完成后洗涤，然后加入底物，进行检测。

夹心ELISA方法可以同时检测两个抗原结合位点，因此能够提高检测的敏感性。

直接ELISA方法是最简单和最迅速的ELISA形式之一、直接ELISA方法是通过将特异抗体直接固定在试验板上，加入样品孵育，接着加入酶标记的第二抗体，再加入底物，进行检测。

直接ELISA方法省去了两次抗体反应的步骤，因此可以节省时间，并且具有较高的灵敏度。

除了上述的几种常见形式外，ELISA方法还可以根据特定需求，进行一些改进和变化。

例如，可以引入荧光物质作为标记物，以进行荧光ELISA；也可以使用化学发光物质作为标记物，进行化学发光ELISA。

这些改进可以进一步提高ELISA方法的灵敏度和特异性。

检测细胞因子的方法

检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法有多种，以下是常用的几种方法：
1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：ELISA方法根据酶标记抗体与目标细胞因子的特异性结合来检测细胞因子的浓度。

这种方法广泛应用于研究和临床实验室中。

2. 流式细胞术（Flow cytometry）：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞因子结合来分析和计数特定细胞子群。

这种方法可以定量分析细胞因子的分布和表达水平。

3. 实时荧光定量PCR法（Real-time PCR）：通过实时荧光定量PCR方法可以检测目标细胞因子mRNA的表达水平。

这种方法可以快速、准确地分析细胞因子的转录水平。

4. 细胞因子芯片（Cytokine array）：细胞因子芯片是一种高通量方法，可以在同一实验中同时检测多个细胞因子。

这种方法可以用来研究细胞因子的分泌模式和相互作用。

5. 免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry）：免疫组织化学染色法可以在组织切片中检测细胞因子的表达情况。

这种方法可以定位细胞因子在组织中的分布和定量分析其表达水平。

植物激素的酶联免疫吸附测定法(ELISA)

植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。

由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。

目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。

直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。

间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。

间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。

根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。

材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。

3 试剂(1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4, 2.96g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。

(2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: 1. A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to adhere to the plastic through charge interactions. 2. A solution of non-reacting protein, such as bovine serum albumin, or casein is added to block any plastic surface in the well that remains uncoated by the protein antigen. 3. Then the serum is added, which contains a mixture of the serum donor's antibodies, of unknown concentration, some of which may bind specifically to the test antigen that is coating the well. 4. Afterwards, a secondary antibody is added, which will bind any antibody produced by a member of the donor's species (for example, an antibody produced in a mouse that will bind any rabbit antibody). This secondary antibody often has an enzyme attached to it, which has no effect on the binding properties of the antibody. 5. A substrate for this enzyme is then added. Often, this substrate changes color upon reaction with the enzyme. The color change shows that secondary antibody has bound to primary antibody, which strongly implies that the donor has had an immune reaction to the test antigen. This can be helpful in a clinical setting, and in R&D. 6. The higher the concentration of the primary antibody that was present in the serum, the stronger the color change. Often a spectrometer is used to give quantitative values for color strength

酶联免疫吸附测定法(ELISA) 标准操作规程

酶联免疫吸附测定法（ELISA）标准操作规程一、适用范围适用于实验室从事ELISA实验的实验技术人员和研究生。

二、操作规程1、标准品的配制：使用前在标准品中加入适量的去离子水，配成10ng/ml的母液，设标准品八管，第一管加入标本稀释液900ul，第二管至第八管加入标本稀释液500ul，在第一管中加入10ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。

如此反复作对比稀释，从第七管中吸出500ul,弃出，第八管为空白对照。

2、检测程序：1）加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应物充分混匀后置37℃120分钟。

2）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3）每孔中加入第一抗工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4）洗板，同前。

5）每孔加酶标抗体工作液100ul。

将反应板置37℃30分钟。

6）洗板，同前。

7）每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8）每孔加入100ul终止液混匀。

9）30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

3、结构计算与判断：1）所有OD值都应扣除空白后在进行计算。

2）以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3）根据样品OD值在该曲线上查出相应的样品含量。

4、注意事项：1) 以上标准孔及样品空均建议做复孔，每次测定时均应做标准曲线。

2) 洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误升高。

3) 板条开封后剩余板条要密封好，保持剩余板条的干燥。

4) 本试剂盒应在4℃保存，仅用于科研，不用于临床。

5) 以上标准曲线的制作和加样流程仅供参考，具体检测时请按试剂盒说明书进行。

酶联免疫吸附测定法elisa

酶联免疫吸附测定法elisa酶联免疫吸附测定法（ELISA）的原理酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种广泛用于生物医学研究和诊断的免疫分析技术。

ELISA 的原理基于抗原抗体特异性结合的原理，通过标记酶的抗体来检测目标抗原或抗体。

ELISA 的种类根据检测方法的不同，ELISA 可分为以下几种类型：直接 ELISA：将待测样品直接加入固定在微孔板上的抗原或抗体上，然后用标记酶的抗体检测。

夹心 ELISA：微孔板固定一层捕获抗体，待测样品通过捕获抗体与检测抗体结合，然后用标记酶的抗体检测。

竞争性 ELISA：待测样品与标记抗原竞争结合固定在微孔板上的抗体，标记抗原和待测样品结合量成反比。

ELISA 的步骤ELISA 的主要步骤包括：抗原或抗体固定：将待测抗原或抗体固定在微孔板上。

样品孵育：将待测样品加入微孔板，进行孵育。

洗涤：去除未结合的样品。

添加标记抗体：加入标记酶的抗体，再次孵育。

洗涤：去除未结合的标记抗体。

底物反应：加入底物，酶促反应产生有色产物。

终止反应：加入终止液，停止酶促反应。

测量吸光度：测量有色产物的吸光度，吸光度与样品中抗原或抗体浓度成正比。

应用ELISA 具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，广泛应用于以下领域：诊断：检测传染性疾病（如艾滋病毒、乙肝）、自身免疫疾病（如类风湿性关节炎）、癌症标志物等。

研究：研究抗原抗体相互作用、免疫应答、药物开发等。

食品安全：检测食品中的残留农药、抗生素等。

环境检测：检测水体或土壤中的污染物。

注意事项进行 ELISA 时需要注意以下事项：抗体的特异性和亲和力：使用的抗体必须具有高特异性和亲和力，以确保准确的检测结果。

样品准备：样品应经过适当的处理，去除干扰物质，以获得准确的结果。

优化条件：ELISA 反应条件（如孵育时间、温度）应经过优化，以获得最佳检测灵敏度和特异性。

背景信号：应使用阴性对照进行检测，以去除背景信号的影响。

质量控制：应使用已知浓度的标准品进行质量控制，以确保检测结果的准确性和可重复性。

酶联免疫吸附实验ELISA

酶联免疫吸附实验ELISA
第3页
再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
第20页
2.1.2 包被方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
第18页
惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
第1页
1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
第2页
在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分开。