全胚胎培养技术及其应用研究进展_韩佳寅

第 35 卷第 5期 2010 年 3月
Vo Ml.a3rc5h, , Is2s0u1e0 5
·综述 ·
全胚胎培养技术及其应用研究进展
韩佳寅1, 2 , 梁爱华 2＊
(1.首都医科大学 中医药学院 , 北京 100069; 2.中国中医科学院 中药研究所 , 北京 100700)
· 549·
第 35 卷第 5期 2010 年 3月
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Vo Ml.a3rc5h, , Is2s0u1e0 5
阶段处于器官发 生早期 , 胚 胎细 胞分化 增殖 活跃 , 器官 形成 迅速 , 对致畸物敏感 , 因此在筛 选致畸原 、评价药物 安全性等 方面发挥了重要 作用 [ 14-15] 。 尿 囊胎 盘形成 之后 的胚胎 培养 存在较大困难 , 此时 的体内 胚胎 与母体 直接 营养沟 通 , 而体 外培养基无法提供与母体相等 效果的养分 , 使得体 外培养胚 胎的生长远远落后于 体内胚胎的生长 。 1.3 培养基和 气体条件 培 养基 作为 WEC成 功与否 的关 键 , 长期以来一直是学 者们 关注 的焦点 。 Nicholas等 [ 9] 早期 采用鸡 血浆 、淀粉琼 脂 、营养琼 脂 、胎盘提取 物 、琼脂 +不同 浓度盐溶液 、鸡血浆 +大鼠胚胎提取物 作为培养基 进行胚胎 培养 , 均未取得 满意 结果 。 New等 [ 16] 通过 实验 证明 同 种血 清是大鼠胚胎体外培养的最佳 培养基 , 且培养效果 与提供血 清的大鼠性别 、是否 怀孕 、是否 与提 供胚胎 的大 鼠为同 一只 等因素无关 。 近年 来 , 一些国 内学 者也 对 WEC的培养 基进 行了进一步探索 。 张天宝等 [ 17-18] 通过实验发现 , 用 人工合成 培养基全部和部分替代大鼠血 清进行全胚胎 培养 , 结果发现 TC-199培养基在添加 60%大鼠血清 后可替代 大鼠血 清作为 培养基 进 行全 胚 胎 培 养 。 单 用 小牛 血 清 及 用 小牛 血 清 + 10%大鼠血清 作为培养基 , 胚胎的生长发育 都不能达到纯大 鼠血清的水平 。 王秋枫等 [ 19] 以 90%人血清 +10%大鼠血清 进行全胚胎培养 , 除胚胎 DNA含量外 , 其他各项生 长分化指 标与大鼠血清培养的胚胎无明 显差异 , 可以作为替 代培养基 用于胚胎早期生长发 育的研究和评价 。
[ 摘要 ] 体外全胚胎培养技术是以体外胚胎替代 整体动物进行实验 的技术 , 主要 用于研 究早期 器官的生 长发育 和化学 物质的胚胎毒性及造成胚胎毒 性的机制等 。 本文就大鼠和 小鼠的 全胚胎培 养技术 及其应 用进行 综述 , 着重介 绍了全 胚胎培 养技术的发展概况 , 应用全胚胎培养技术的注意事项及全胚胎培养技术在 生长发育研 究 、环 境污染物和 重金属的胚 胎毒性研 究 、药物安全性评价 、中药的胚 胎毒性及其机制研究领域的应用 , 并就该技术在中药 生殖毒性研究中的应用前景进行了讨论 。
目前用于 WEC最常 用的 培 养基 为同 源 即刻 离 心 血清 (immediatelycentrifugalserum, ICS), 即 用 于大 鼠 WEC的培 养基为成年健康大鼠麻醉后经 腹主动脉快速 抽血 、立即离心 后而分离的血清 。
气体环境是决定 WEC培 养效果的 另一 重要因 素 。 New 等 [ 10] 发现 , 在 气体系统 中加入 5%CO2能 够起到中 和碳酸氢 盐 , 维持培养基 pH的作用 , 有益于胚胎的生长发育 。 氧在哺 乳动物胚胎器官发育期的代谢 过程中起到重 要作用 , 合适的 氧浓度是 WEC成 功与 否的关 键 。 氧 浓度过 高会 导致氧 化 , 氧浓度过低则会 造成代 谢性应 激 。 New等 [ 20] 在 确定 CO2气 体含量后 , 又将 O2限定到 20% ～ 95%, 观 察胚 胎发 育情 况 , 发现随着胚胎生长发 育的进行 , 耗氧量将会增加 。
卵 圆柱期 之前胚 胎培养 主要指 胚胎从胚 泡生长 到卵圆 柱的过程 , 主要用来观察胚层的分化 。 此时培养的 胚胎与体 内生长的胚胎在显微结 构上有很大相似性 , 但生长 较体内缓 慢 , 并且培养的成功率很低 。 卵圆柱期 到尿囊胎盘 形成之前 的胚胎培养 , 特别是 头褶 期 和体 节阶 段早 期胚 胎 (小鼠 8.5 d, 大 鼠 9.5 d)培养 48 h后 , 胚胎的存活率 、生长发育 、器官分 化与体内都有 很好的 一致 性 , 是 WEC的主要 阶段 。 由于本
而二甲基亚砜 和乙醇则 由于具 有较 强的胚 胎毒 性不 能作为 WEC受试品的溶剂 [ 30] 。 3 WEC技术在生长发育和毒理学中的应用 3.1 生 长发育研究 Spezia等 [ 31] 应用 WEC技术 将 12 d小 鼠胚胎培养 30 h, 通 过生嵴 裂的 分化判 断性 别 , 取得 了良好 效果 。 FujinagaM[ 32] 利用 WEC过程 包含身体 许多不 对称结 构的发育过程 的 特点 , 应 用其 研究 身体 L/R轴 线 的发 育机 制 。 InoueYU等 [ 33] 应用分子生物 学技术 结合 WEC技术研 究钙粘素在后 脑区室化 中的作 用 , 得到 Cdh6在 后脑 区室化 中的作用可能 受到 Hox基因 调节 网控 制的 结 论 。 NagaseM 等 [ 34] 通过向 8 ～ 9.5 dWEC系统中加入环 王巴明或介 芬胺 , 观察在血管形态形成期 特异性抑制刺猬因子 的效应 , 证实刺 猬因子在小鼠 卵黄囊时期血管发生中具有 不可或缺的 作用 。 Liu等 [ 35] 应用 WEC技术培 养受 孕 13.5 ～ 14.5 d胚胎 , 发现
目前广泛应用的 WEC气体系统 是由 O2, CO2, N2 3种气 体组成 。 分别于培养开始时 、第 16, 26小时往 培养瓶 内充入 混合气体 , 其比例变化依次为 O2-CO2-N2 (5∶5∶90, 20∶5∶75, 40∶5∶55)。 1.4 胚胎发育 评价方法 胚胎的发育 情况可以下 述指标进 行评价 :①存活率 :以可见 心搏为 存活指 标 [ 21] 。 ②胚 胎组织 器官形态分化 :大鼠胚胎用 Brown形态学计 分法评价 胚胎各 器官的形态分化 [ 3] , 小鼠胚胎用 Van形 态学评分系统评价胚 胎组织器官分化终点 [ 22] 。 ③卵 黄囊 (visceralyolksac, VYS) 组织检查 :可以将 VYS迅速 用 3.0%戊二 醛固 定 , 制备 扫描 电镜标本进行 超微 结构 观察 ;也 可制 备 HE染 色切 片 , 观察
[ 收稿日期 ] 2009-07-01 [ 基金项目 ] 国家自然科 学基金 项目 (30873434);国家 科技部 重大 专项 (2009ZX09301-005-08);中国中医科学院自选课题 (2007) [ 通信作者 ] ＊梁爱华 , Tel:(010)64288601, E-mail:liangaihua@
[ 关键词 ] 全胚胎培养 ;胚胎发育 ;生殖毒性 ;安全性评价
体外全胚胎 培养 技术 (wholeembryoculture, WEC)是一 种将动 物 的 完 整 胚 胎 移 植 到 体 外 进 行 培 养 的 实 验 技 术 。 Nicholas于 1934年采用血浆作为培养基 , 证明大鼠 胚胎能够 在母 体外 培养 成活 24 ～ 36 h, 从 而创 立了 该实 验方 法 。 之 后 , 科学家们对培养基以及培养方法等条件不断改善 。 20世 纪 80年代 , Brown制定了用于评价胚胎 的生长和分化情况的 评分系统 , 作为评价胚胎发 育程度的 指标 [ 1] 。 目前 , WEC已 经被广泛用于胚胎发 育 、化合物的胚胎 毒性和致畸 性研究以 及药物的安全评价等 [ 2-3] 。 能够用于 WEC的胚胎材 料来源 广泛 , 鱼类 、两栖 类 、鸟类 、哺乳 类胚 胎均可 用 于实 验 。 采用 上述动物胚胎进 行的各 种研 究均已 见文 献报 道 , 例 如 , 朱小 山 、端正花等 [ 4-5] 应用斑 马鱼胚 胎分 别研究 了富 勒烯和 双酚 A的胚胎毒性 ;LiXY等 [ 6] 应用蛙卵研究了 1-甲基 -3-辛烷基 咪唑啉酮溴化物对胚 胎发育的影响 ;AlvarezI等 [ 7] 应 用鸡胚 胎研究 了 成 纤 维 细 胞 生 长因 子 (FGFs)的 神 经 诱 导 作 用 ; HansenJM等 [ 8] 采用兔 胚胎与 大鼠 胚胎对 比研 究了谷 胱甘 肽和半胱氨酸在反应 停致畸中的作用等 。 目 前 , 利 用大鼠或 小鼠器官形成期的 胚胎 通过旋 转培 养方法 进行 化合物 的致 畸研究最为常见 。 本文 主要对 大鼠 和小鼠 的全 胚胎培 养技 术及其应用进行综述 。 1 WEC技术及其发展概况 1.1 培养方法 全胚胎培养技术经历 了从静态培 养向旋转 培养发展的 过程 。 20 世 纪 30 年 代 , Nicholas等 [ 9] 建 立 了早 期的体 外 静态 胚 胎 培 养技 术 。 以 大鼠 肝 素 化 血 清与 大 鼠
14 ～ 15 d的胚胎提 取物混合作为 培养基 , 可使 得大鼠 胚胎在 体外生长 。 然而 , 胚胎生 长的 时间较 短 , 一般 在培养 的 24 h 内生长 , 而 36 h后胚胎生 长速度 即减 慢 。 培养 48 h内正常 生长的胚胎不 到一半 , 正常分化的胚胎只有 3/4。
New等 [ 10] 通 过静态培 养法 , 以血浆凝块 作为培养基 , 并 在培养过程中 通入 4% ～ 5%CO2气体 , 有效地 提高了 体节阶 段早期胚胎的生长发育 率 。通过 该实验还发现 , 通入 60%的 O2气体对于胎龄较长 的胚 胎的生 长发 育率有 提高 作用 。 在 此之后 , New[ 11] 对其 技术进 行了 改进 , 其设 计的 循环 器装置 采用循环的同源离心血 清培养基进行胚胎培 养 , 在 培养过程 中通入 95%O2和 5%CO2气体 。结 果证明 , 除在 30体节胚胎 无法建立血管与尿囊胎 盘的连接外 , 胚 胎生长发育 和器官分 化均与体内同 龄胚胎 无显 著性差 异 。 由于 循环 器装 置较复 杂 , New等 [ 12] 随后 又设计 了一 套更 为简便 的充 气旋转 瓶装 置 , 采用旋转培养法 , 其 培养效 果与 循环培 养器 装置 的培养 基本一致 。 目前所采用 的 WEC技术基本上是在 New的 实验 基础上改进而 来 , 即采用大鼠或小鼠受孕后 8 ～ 10 d的胚胎 , 在合适的气体环境和适 当的培养基条件下 , 进行旋 转培养一 定时间后 , 根据研究目的进行胚胎评价 。 1.2 胚 胎期的选择 体外胚胎培养依 据胚胎移出 母体时所 处的 阶段主 要分为 3 类 :卵圆柱 期之前 胚胎培 养 , 卵 圆柱期 到尿囊胎盘形 成之前的胚胎培养 , 尿囊 胎盘形成之 后的胚胎 培养 [ 13] 。