第二章 预处理技术

可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活，浆液分离困难
物 超声破碎法 理 破 渗透压法 碎
反复冻融法
液体剪切作用
渗透压剧烈改变 反复冻结-融化
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
破碎率较低，常与其他方法结合使用
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物
干燥法
改变细胞膜的渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
4. 加入助滤剂
助滤剂有 硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、 炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。
助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤 介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入 发酵液，也可两种方法同时使用。 助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量
2. 目标产物测定法
将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测 定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量 或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比 较，计算其破碎率。
Rm：理论最大值，R：实验测得值。
3. 测定导电率
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释 放到水相，使导电率上升。导电率随着 破碎率的增加而呈线性增加。
⑥成分复杂，杂质较多。
这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难
一、改善发酵液过滤特性的方法：
1. 降低液体黏度 2. 调整pH 3. 加入反应剂 4. 加入助滤剂 5. 凝聚 6. 絮凝
1. 降低液体黏度
常用的方法有加水稀释法和加热法。加水 稀释法会加大后续过程的处理任务。
注意事项：严格控制加热温度与时间。首先， 加热的温度必须控制在不影响目的产物活性 变质的范围内；其次，温度过高或时间过长， 会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液 的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠→形成草酸钙 沉淀（注意回收草酸）
2. Mg2+——三聚磷酸钠(Na5P3P10)→形成 三聚磷酸钠镁可溶性络合物
3.Fe2+ ——黄血盐(K4Fe(CN)6) →普鲁士蓝 沉淀
（二）杂蛋白的去除方法 1. 沉淀法 2. 变性法 3. 吸附法
有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分 为三类：
①非离子型、 ②阴离子型（含有羧基） ③阳离子型（含有胺基）
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
第三节 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、 细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态， 使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤 速率。常用于菌体细小而且粘度大的发 酵液的预处理。
一、凝聚
概念
凝聚——是指在某些电解质作用下，破 坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分 散状态，使胶体粒子聚集的过程。
导电率的大小取决于微生物的种类、处 理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液 中原电介质的含量等，因此，正式测定 前，应预先用其它方法测定标准曲线。
三、 细胞破碎的方法（按细胞所受作用）
分类
作用机理
适应性
高压匀浆法 液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌
珠磨法
固体剪切作用
2. 调整pH
此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方 法之一，方法简单有效、成本低廉。
如利用酸碱性来调节pH值使蛋白质等两性 物质达到等电点得以除去。又如过滤中，发 酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过 调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可 减少堵塞和污染。
3. 加入反应剂
加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应 生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。 生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具 有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并 且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过 滤性能。
X-press法 固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合
化 酶溶法 学 破 化学渗透法 碎
酶分解作用 改变细胞膜渗透性
具有高度专一性，条件温和，浆液易分 离，溶酶价格高，通用性差
具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低，通用性差
1.物理破碎
高压匀浆法 珠磨法 超声破碎法 渗透压法 反复冻融法 干燥法 X-press法
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂， 要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过 滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过 程，称为混凝。
第四节 细胞破碎
一、细胞壁结构和特点 二、细胞破碎率效果的检验 三、细胞破碎的方法 四、选择破碎方法的依据 五、破碎技术的发展方向
概念
细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机 械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和 细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释 放到液相中。
3. 常用的絮凝剂
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类 衍生物、聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚 合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶 粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、 脱乙酰壳多糖等。
3. 常用的絮凝剂
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂:
性剂等。
不足之处
a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物； b. 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要
消耗大量酸碱； c. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量
较少的场合。
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 ①在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的
协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附 蛋白质； ②在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二 钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及 其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。
一、凝聚
原理：发酵液(培养液)中细胞、菌体或蛋白质
等胶体粒子的表面都带有同种电荷，使得这些 胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互 相凝聚。另外，这些胶体粒子和水有高度的亲 和性，其表面很容易吸住水分，形成一层水膜， 从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液(培养 液)中加入电解质，就能中和胶体粒子的电性， 夺取胶体粒子表面的水分子，破坏其表面的水 膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。
二、絮凝
概念
絮凝——指使用絮凝剂(通常是天然或 合成的大相对分子质量物质)，在悬浮 离子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗 大的絮凝团的过程。
二、絮凝
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物， 其相对分子质量可高达数万至一千万以上， 长链状结构，其链节上含有许多活性官能 团，包括带电荷的阴离子（如---COOH） 或阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷 的非离子型基团。
(1) 高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎的常用方法
3. 细胞壁的结构与细胞的破碎
在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细 胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎 难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、 壁厚、聚合交联程度高则难破碎。
在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞 壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。
二、细胞破碎效果的检查
破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原 始细胞数量的百分数，即
(2) 常用的凝聚剂
无机 盐类：
Al2(SO4)3.18H2O (明矾)、 AlCl3.6H2O、FeCl3 、 ZnSO4 、 MgCO3等
金属氧 化物类：
Al(OH)3、 Fe3O4 、 Ca(OH)2或石灰等
阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为： Al3+>Fe 3+ >H+> Ca2+> Mg2+ >K + >Na + >Li +
(11-22%) 蛋白质
磷脂
(6-8%）
蛋白质 脂类
(8.5-13.5%)
多层
多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质
1.微生物细胞壁的化学组成和结构
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的 网状结构，网状结构越致密，破碎的难 度越大； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于 壁结构交联的紧密程度和它的厚度；
*发酵液预处理的主要包括： ①发酵液过滤特性的改变；
②相对纯化。
2.1 发酵液过滤特性的 改变与相对纯化
微生物发酵液的特性为：
①发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水； ②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③固体粒子可压缩性大； ④液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧 化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素 的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的 细胞壁有所提高。
2.植物细胞壁的化学组成和结构
成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 细胞不再增大。
初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。
第二章 预处理技术
2.1 概述 2.2 发酵液过滤特性的改变与相对纯化 2.3 絮凝与凝聚 2.4 细胞破碎 2.5 离心技术
2.1 概述
生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：
①动物组织和器官要先除去结缔组织、脂 肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的 溶剂形成细胞悬液。
②植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎， 选择适当的溶剂形成细胞悬液。
其中N0：原细胞数，N：破碎后残存 的正常细胞。N0和N的可通过直接测 定法、目的产物测定法和测定导电率 得到。
1.直接测定法
方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或 在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞 的技术。