基因组文库和cDNA文库的比较(课堂PPT)

分子生物学实验技术ppt课件

质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法：基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化（ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的噬菌体展示库。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离蛋白质分析蛋白质相互作用的研究方法：酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构建

cDNA文库和基因组文库比较

个人收集整理-ZQ文库和基因组文库比较文库:以为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成，与适当地载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部信息地克隆集合称为该组织细胞地文库.基因组文库: 一个生物体地基因组用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体分子中，所有这些插入了基因组片段地载体分子地集合体，将包含这个生物体地整个基因组，也就是构成了这个生物体地基因文库. b5E2R。

基因组文库与文库地比较:基因组文库地优点相对于文库,基因组文库地优点: 克隆只能反映着地分子结构,没有包括基因组地间隔序列, 文库中,不同克隆地分布状态总是反映着地分布状态,即:高丰度地克隆,所占比例较高,分离基因容易;低丰度地克隆,所占比例较低,分离基因困难; 从克隆中,不能克隆到基因组中地非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列地结构与功能. p1Ean。

文库地主要优点：①文库以为材料,特别适用于某些病毒等地基因组结构研究及有关基因地克隆分离.②文库地筛选比较简单易行.③每一个文库都含有一种序列,这样在目地基因地选择中出现假阳性地概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义地,由此选择出来地阳性克隆将会含有目地基因.DXDiT。

④文库可用于在细菌中能进行表达地基因地克隆,直接应用于基因工程操作.⑤克隆还可用于真核细胞地结构和功能研究.克隆地主要地缺点：文库所包含地遗传信息要远远少于基因组文库,并且受细胞来源或发育时期地影响. 文库虽能反映地分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列地结构与功能方面信息. 在文库中,相应于高丰度地克隆所占地比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度地克隆所占地比例则比较低,因此分离也就比较困难.RTCrp。

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基因库、基因文库、部分基因文库的区别

1、基因库、基因文库（或基因组文库）、部分基因文库（如cDNA文库）的区别（1）基因库：一个种群中全部个体所含有的全部基因，叫做这个种群的基因库。

（2）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

（3）部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。

如：cDNA文库。

2、自交与自由交配的区别（1）自交强调的是相同基因型个体的交配，如基因型为AA、Aa群体中自交是指：AA x AA、Aa x Aa。

（2）自由交配强调的是群体中所有个体进行随机交配，如果基因型为：AA、Aa群体中自由交配是指：A A♀x Aa♂、AA x AA 、Aa x Aa 、A A♂x Aa♀（3）如果自由交配（随机交配），计算后代基因型频率，要先算出基因频率，然后按遗传平衡定律进行计算。

（A + a）2展开再进行；如果算后代显性个体杂合子的概率，要Aa/AA+Aa 来计算。

（4）基因位于性染色体上的基因频率的计算：在X染色体上的，Y没有，算基因频率时，不用算Y的；X B、X b基因频率在男女上的基因频率是一样的。

性染色体上基因频率问题性染色体基因在群体中的状况要比常染色体基因复杂。

以XY型性别决定方式为例：雌性个体有两条X染色体，一条来自父方，另一条来自母方，因而携带有两份X染色体上的基因；而雄性个体只有一条来自母方的X染色体，因而只携带一份X连锁基因。

因此，X染色体上的基因在群体中的分布就处于不平衡状态。

雌性个体的性连锁基因占群体的三分之二；而雄性个体只会有剩余的三分之一。

由于高中阶段一般只考虑X染色体上的基因，不考虑Y染色体的基因，因此，求性染色体上一对等位基因频率实际上是求X染色体上一对等位基因的基因频率。

【例】从某个种群中随机抽出100个个体，测知基因型为X B X B、X B X b、X b X b和X B Y、X b Y的个体分别是44、5、1和43、7。

基因组文库和cDNA文库的比较

核采用质粒载体或λ载体）。下面介绍三种率低、文库不易贮存，Cosmid使用不如λ 噬菌体载体普母人工染色库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的 c复杂性低、筛选
假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基因组结构和基因克隆分离。03 基因组优点基因组含有全部基因，
cDNA只含有全部蛋白质编码的结构基因且受
02 构建双链DNA合成方法
大肠杆菌 RNaseH酶降解取代法
Oligo寡聚引物引导法
PCseH
酶降解取代法02 构建Oligo寡聚引的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第一链
公式:N=ln（1-P）/ln（1-f）, 实际克隆段化
物理学方法：机械类或超声波等生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体或λ载体。
重组CONTENTS01 基因组 02 cDNA 03 两者比较
01基因组概念构建（原核）构建（真核）0载体贮存在一个受体菌的群体中反映 mRNA信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK YOU!

cDNA文库和基因组文库比较

cDNA文库和基因组文库比较cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

基因组文库: 一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。

基因组DNA文库与cDNA文库的比较:1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库,基因组文库的优点: cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构,没有包括基因组的间隔序列, cDNA文库中,不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态,即:高丰度mRNA的cDNA克隆,所占比例较高,分离基因容易;低丰度mRNA的cDNA克隆,所占比例较低,分离基因困难; 从cDNA克隆中,不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能.2 cDNA文库的主要优点：①cDNA文库以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.②cDNA文库的筛选比较简单易行.③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义的,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因.④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆,直接应用于基因工程操作.⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究.3 cDNA克隆的主要的缺点：cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响. cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息. 在cDNA文库中,相应于高丰度mRNA 的cDNA克隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低,因此分离也就比较困难. 3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。

cDNA和基因组文库DNA的构建

• [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 1 . 7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。
2：cDNA第二链的合成
• 2 . 1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、
• 10mMol/L mgcl2 70ul • 2mM/L Tris-Hcl(PH7.4) 5ul
结构环状
线状环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状环状环状线性染色体
哺乳动物细胞动物细胞
环状环状
动物细胞和细菌
环状
插入片段很小， <8kb 9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,T-载体,
• 2 . 8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。 [第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg xμg)=cDNA第二链合成量/μg x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的 70~80% 2 . 9.用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。
5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
•
Sepharose CL-4B柱的制备 5 . 1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。 5 . 2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有 0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体。

比较基因组学PPT课件

2020/3/14
13
基因组比较作图Comparative mapping
利用共同的遗传标记(分子标记、cDNA克隆、基因克隆)对相关物种进行遗传/物理作图；
比较遗传标记在相关物种基因组中的分布情况，揭示物种间DNA或DNA片段上的同线性synteny、共线性collinearity、微共线性microsynteny；
19
基于芯片技术的比较基因组学研究
以已知序列基因组为参考，通过芯片技术，进行未测序基因组与参考基因组间的比较基因组杂交分析；
检测待比较基因组中对应DNA区域的存在、缺失、变异；
成本较低，研究结果可靠性较高，应用前景广阔。
2020/3/14
20
基因组成的相似性
基因共线性：基因排列顺序的一致性；
物种酵母
完成年份
1996
线虫
1998
果蝇
2000
拟南芥
2000
人类第22染色体 1999
人类第21染色体 2000
人类全基因组
2001
(Public Sequence)
人类全基因组
2001
(Celera Sequence)
总长度 Mb 12 96 116 115 34 33 2693
2654
已完成总长的百分数/% 93 99 64 92 70 75 84
31
模式生物具备的基本条件
容易培养，成本低廉，随时获取以供实验研究，繁殖周期短；
能在短时间内产生大量的后代，满足研究分析的需求；
十分方便地取得种内的遗传变异体；已经过长期研究取得该物种的丰富背景
信息。
32
模式生物基因组研究特点

基因组文库、cDNA文库的构建和筛选

示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
• 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA 之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行
点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点。
载体
• 质粒载体—用于基因组较小的生黏粒—45kb 细菌人工染色体（BAC）—350kb 酵母人工染色序列• 具有代表性的基因应该在最大限度上覆盖所有的原初序列。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-2cDNA内部，在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。
• 最后用T4DNA连接酶连接。
cDNA末端的处理
• 末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部
末端转移酶末端转移酶
与载体的连接
• 载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体自连接。
• T4DNA连接酶连接载体与c龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。
（1原）位原位杂杂交交筛筛选选

cDNA文库制备ppt课件

3）器官特异性有的结构基因的表达就有器官特异性，故由同代谢阶段（或发育阶段）的结适用于RNA病毒的基因组结构研究。 2）出现假阳性的概率较低。 3）有效地分析间断基因的结构。 4）发育过程中时间调节基因及组织特异广的分级分离法，可以方便快速地去除小于500bp的分子。
五、cDNA克隆载体
cDNA克隆载体有两种，噬菌体类载体和插入片断的装载容量大，适合与全长 cDNA的克隆。此类载体可表达。
接上人工接头
粘性末端末端转移酶CCC
CCC
同聚物加连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的正确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是全长的cDNA，还是链合成
cDNA第二链的合成：将上一步形成的mRNA -cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。常用方法：
①自身引导合成法；
②置换合成法；
自身引导法合成cDNA第二链
置换合成法合成cDNA第二链
四、双链cDNA的分级分离
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
双链cDNA在与载体连接之前最好经过cDNA分级分离，回收大于5 00bp的cDNA用于连接。
一、mRNA的分离纯化
总RNA中绝大多数是rRNA和tRNA， mRNA只占总RNA的1%-5%。原理：利用mRNA的polyA尾巴，将 mRNA从总RNA中分离纯化。目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法（3）寡聚（dT）－磁性球珠法
寡聚（dT）－纤维素柱层析
二、cDNA的第一链合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录酶催化。反转录酶常用的反转录酶有2种： 1）AMV（禽成髓细胞癌病毒） 2）M-MLV（Moloey鼠白血病病毒）都是依赖于RNA的DNA聚合酶，有 5’→3’DNA聚合酶活性。前者最适温度为 42℃，后者为37℃。

基因组文库和cDNA文库的比较(方案).ppt

S01 基因组 02 cDNA 03 两者比较
01基因组概念构建（原核）构建（真核）0载体贮存在一个受体菌的群体中（1-f）, 实际克隆合成方法
大肠杆菌 RNaseH酶降解取代法
Oligo寡聚引物引导法
PCseH
酶降解取代法02 构建Oligo寡聚引比较cDNA优点基因组优点谢谢精选文档尽在此间
材料影响cDNA能反映 mRNA信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK Y于筛选困难、重组效率低、文库不易贮存，Cosmid使用不如λ 噬菌体载体普母人工染色库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的 c制备基因组DNA并片段化
物理学方法：机械类或超声波等生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体或λ载体。
重组核采用质粒载体或λ载体）。下、筛选
假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基因组结构和基因克隆分离。03 基因组优点基因组含有全部基因，
cDNA只含有全部蛋白质编码的结构基因且受
公式:N=ln的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第一链

基因文库概念高中生物

基因文库概念
基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。

如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。

cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。